オイルレッドO染色:in vitroで肝脂肪症を検出するための肝細胞中性脂質染色技術

脂肪肝は、肝細胞(顕著な肝細胞型)への脂肪の過剰な蓄積を特徴とする病的状態です。脂肪は、肝細胞の細胞質にさまざまなサイズの脂質滴の形で沈着します。

構造的には、脂質液滴には、トリグリセリドやコレステロールエステルなどの中性疎水性脂肪のコアが含まれています。コアは、さまざまなタンパク質で装飾されたリン脂質単層で囲まれています。

脂肪沈着を視覚化するには、接着肝細胞培養物を含むマルチウェルプレートを取ります。細胞は脂肪原性培地で前処理され、細胞内に脂質滴の蓄積が誘導されます。

所望の濃度のパラホルムアルデヒドを加え、細胞内に拡散し、タンパク質を架橋します。このステップにより、プロテアーゼが不活性化され、肝細胞構造が維持されます。パラホルムアルデヒドを捨て、イソプロパノールに溶解した有機染料を含むオイルレッドO溶液を加えます。

イソプロパノールは、溶解性の低いオイル-レッド-O分子のキャリア溶媒として機能します。これにより、色素分子が固定された肝細胞に入り、最終的に脂質液滴に到達するのを助けます。中に入ると、染料は親和性が高いためイソプロパノールから中性脂質に移行し、色素と脂質の複合体を形成します。これにより、脂質滴が赤く着色されます。

余分な色素を捨て、顕微鏡で細胞を観察します。細胞内脂質滴は濃い赤く見えます。

24ウェルプレートのすべてのウェルに細胞培養カバーガラスを入れ、テキスト原稿に記載されているように、HepG2細胞を播種します。適切なインキュベーション後、細胞を1ミリリットルのPBSで洗浄し、上清を廃棄します。PBS中の1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで固定し、室温で1時間インキュベートします。余分なパラホルムアルデヒドを捨て、細胞を1ミリリットルの蒸留水ですすいでください。

次に、1ミリリットルの70%イソプロパノールを加え、5分間インキュベートします。余分なイソプロパノールを捨て、1ミリリットルのオイルレッドO溶液を加え、30分間インキュベートします。余分なオイルレッドO溶液を捨て、1ミリリットルの蒸留水ですすいでください。細胞を顕微鏡で400倍の倍率で観察します。