ナイルレッド染色:藻類中の細胞内中性脂質を検出および定量する技術

藻類は、さまざまな脂質を生成する水生光合成生物であり、そのうち中性脂質はバイオディーゼルの生産に不可欠です。

中性脂質を検出および定量するには、最適な量の藻類懸濁液とエタノールを黒色のマイクロタイタープレートウェルで混合します。ほとんどの汚れの浸透を防ぐ藻類の細胞壁と膜は、エタノールにさらされると透過性になります。次に、エタノールを脂溶性蛍光染料 - ナイルレッドと組み合わせます。この混合物を藻類を含むウェルに加えます。

マイクロタイタープレートを分光光度計に入れます。染料と藻類の間の相互作用を促進するために、断続的な振とうでインキュベーションを確実にするプログラムを設定します。

ナイルレッドは疎水性であるため、細胞質を簡単に通過することはできません。エタノールなどの溶媒は、ナイルレッドと結合すると、染料を動員し、細胞質に分散した脂質体に到達するのを助けます。その後、ナイルレッドが脂質体に浸透してそこで可溶化し、脂質を染色します。

脂質欠乏細胞は暗い体の蛍光リングとして現れますが、脂質が豊富な細胞は脂質体が蓄積している場所に明るいオレンジがかった赤色の輝きを示します。

細胞を染色した後、中性脂質を最大限に励起する波長に曝露します。得られた蛍光を記録し、それを検量線と関連付けて、試験サンプル中の中性脂質を定量します。

蛍光定量では、測定に使用する標準物質と同じバイオマス濃度で、同じ方法ですべての藻類サンプルを調製します。これを行うには、事前に乾燥したサンプルを適切な量のリン酸緩衝液に懸濁します。必要に応じて、ホモジナイザーを使用して乾燥藻類細胞の再懸濁を促進します。

各サンプルについて、調製した30%エタノール溶液80マイクロリットル、調製したナイルレッド溶液10マイクロリットル、および藻類懸濁液10マイクロリットルを96ウェルプレートの1つのウェルに混合します。蛍光測定の変動性を適切に考慮するために、各サンプルを5回繰り返します。次に、装置と調製の日々の変動を考慮して、事前に調製した標準物質で 2 点検量線を実行します。

マルチウェルプレートリーダー分光光度計で蛍光測定を実行するには、パラメータを1,200 rpmで振とうし、3ミリメートルを30秒間周回するように設定し、その後摂氏40度で10分間インキュベートします。1,200 rpmでもう一度振とうし、3ミリメートルを30秒間周回し、530ナノメートルで励起、604ナノメートルで発光して蛍光を記録します。次に、実行を開始します。最後のステップとして、内部標準からの結果を使用して、蛍光測定値を油分に変換します。