大動脈血管平滑筋細胞のフォンコッサ染色:動脈内側層石灰化の評価のためのインビトロ技術

血管平滑筋細胞(VSMC)は、血管壁の中間層である中膜の顕著な細胞成分です。病理学的手がかりや老化に反応して、これらの細胞は血管石灰化、つまり細胞外マトリックスにカルシウムが蓄積する現象を媒介します。

石灰化前のマウス大動脈VSMC培養物の接着層を含むマルチウェルプレートを取ります。細胞をホルマリン溶液でインキュベートして細胞タンパク質を架橋し、染色前にVSMC構造を安定させます。

ウェルからホルマリンを吸引し、硝酸銀溶液を加えることによってフォンコッサ染色を開始します。プレートを適切な光源の下でインキュベートします。

硝酸銀溶液がVSMC層の細胞外マトリックスの石灰化部位に到達すると、銀イオンはリン酸塩に結合したカルシウムイオンに置き換わります。これにより、一時的な黄色の着色が発生します。有機物と光の存在下では、リン酸銀の光化学的分解により、黒色の金属銀が形成されます。

使用済み硝酸銀溶液の最大量を廃棄します。チオ硫酸ナトリウム溶液で細胞を処理します。この溶液は、残留銀塩を水溶性複合体に変換し、最後に水ですすいで除去し、染色のコントラストを向上させる。

染色された細胞を画像化して、石灰化を示す不溶性の黒い沈着物を見つけます。

血管平滑筋細胞に石灰化を誘発するには、細胞を6ウェル培養プレートに移し、接着させます。次に、石灰化培地で細胞を再供給します。細胞を摂氏37度で少なくとも7日間インキュベートします。その後、細胞培養プレートから培地を吸引します。細胞を脱イオン水で一度洗浄します。

細胞を1ミリリットルの10%ホルマリンに室温で20分間入れて固定します。次に、ホルマリンを取り除き、固定細胞を蒸留水で5分間洗浄します。

次に、細胞を1ミリリットルの5%硝酸銀溶液で60〜100ワットの電球の下で1〜2時間インキュベートします。その後、硝酸銀溶液を吸引し、蒸留水で5分間洗浄します。5分後、細胞を1ミリリットルの5%チオ硫酸ナトリウム溶液に蒸留水中で5分間入れて、未反応の銀を除去します。その後、細胞を蒸留水で5分間すすぎます。フォン・コッサで染色された細胞は、標準的な倒立光学顕微鏡でイメージングする準備が整いました。