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エンベロープウイルスの陰性染色には、目的のウイルス懸濁液から始めます。ウイルスを化学固定剤であるグルタルアルデヒドでインキュベートします。グルタルアルデヒドは浸透すると、ウイルスタンパク質と核酸を架橋し、形態を維持しながらウイルスを不活性化し、それによって安全なウイルスの取り扱いを促進します。この混合物をマルチウェルプレートに移します。
透過型電子顕微鏡、TEM、カプセルを含むグリッドをカプラーを介してピペットに取り付けます。ピペットを使用して、ウイルス固定混合物をカプセルに吸引します。ピペットアセンブリをインキュベートして、ウイルスがグリッド表面に吸着します。
混合物を取り除きます。カプセルを洗浄し、非付着性ウイルスや固定剤を取り除きます。重金属ベースの染色剤である酢酸ウラニルの溶液をカプセルにピペットで入れます。染色剤がウイルスに接触できるようにインキュベートします。
ウラニルイオンは、ウイルス表面の特定の膜糖タンパク質およびリン脂質に結合します。イオンはウイルスに浸透し、ゲノムを囲むヌクレオカプシドタンパク質に結合する可能性があります。この結合により、ウイルスや特定のウイルス構造の周囲に重金属イオンの凝集と沈着が誘導されます。
カプセルを分離します。グリッドから余分な汚れを取り除き、自然乾燥させます。
TEM イメージング中、高エネルギーの電子ビームがウイルスを通過し、ウイルスの電子密度の高い染色領域により多くの電子が散乱します。しかし、ウイルスの全体的な電子密度が低いため、電子は通過することができます。イメージングシステムは、これらの異なる散乱電子を処理し、高コントラストの画像を生成します。
陰性染色されたウイルスは、暗い境界に対して暗いヌクレオカプシドで明るく見え、超微細構造の視覚化が容易になります。
まず、ウイルス懸濁液を等量の 4% グルタルアルデヒドと混合して、最終濃度 2% グルタルアルデヒドを達成します。固定剤を使用して、少なくとも24時間ウイルスを不活化します。チューブを除染し、BSL2-EM施設に移します。
この後、グリッドロードされたキャプチャをピペットに取り付けます。混合物をカプセルに吸引します。グリッドを水平に向けた状態でピペットを横に10分間置きます。
次に、ピペットを手に取り、ウイルス混合物を廃棄物容器に排出します。40マイクロリットルの脱イオン水をカプセルに吸引し、廃棄物容器に捨てます。この洗浄を3回繰り返します。
この後、40マイクロリットルの1%UAまたは1%PTAのいずれかをカプセルに30秒間吸引します。ピペットからカプセルを取り出します。ろ紙を使用してグリッドを吸い取り乾燥させ、グリッドを自然乾燥させます。