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軟部組織微小環境における細胞質特異的染色のために、採取したばかりのマウス腎臓を入手します。ホルムアルデヒド、氷酢酸、メタノールを含む固定液で処理します。低温でインキュベートします。
ホルムアルデヒドは細胞に浸透し、タンパク質とタンパク質、タンパク質を核酸に架橋します。メタノールは組織から水分を置換し、タンパク質を凝固させます。酢酸は細胞内の酸性化と組織の腫れを引き起こし、それによってメタノールによって引き起こされる組織の収縮を打ち消します。
固定は酵素を不活性化し、その後の染色のために組織形態を安定させます。バッファーを使用して余分な固定剤を除去します。組織を酸性色素であるエオシンYでインキュベートします。
エオシンは固定細胞に浸透し、細胞質に入ります。酢酸処理による細胞質の酸性環境は、細胞質タンパク質のアミノ基の最大のプロトン化を引き起こします。
負に帯電した官能基を持つエオシンは、タンパク質のプロトン化基と静電的に相互作用し、安定した色素-タンパク質複合体を形成し、蓄積すると細胞質をピンク色に染色します。インキュベーション後、染色した腎臓を細かく切断し、続いてエタノール濃度を上げて組織を脱水します。
腎臓組織をパラフィンワックスに埋め込みます。ミクロトームを使用して薄い組織切片を取得します。さらに、顕微鏡分析のために切片を再水和します。
染色されていない細胞核は、ピンク色に染色された細胞質に対して白く見え、ブラシ境界のある上皮細胞や、ブラシ境界のない平らな上皮細胞で裏打ちされた集合管で構成される近位の複雑な尿細管などの腎臓の微細構造を視覚化できます。
軟部組織サンプルを固定することから始めます。50ミリリットルの遠心分離管に、9.5ミリリットルの4%ホルムアルデヒドと0.5ミリリットルの氷酢酸を含む固定液を満たします。軟部組織サンプルを遠心分離管に加え、24〜72時間冷蔵します。
冷蔵後、軟部組織サンプルをDPBS溶液で1時間洗浄します。次に、サンプルを2ミリリットルのエオシンY染色液に入れて染色し、水平振とうプレート上で24時間インキュベートします。
翌日、軟部組織サンプルをサンプル容器から慎重に取り出し、セルロースティッシュペーパーで余分な染色剤を取り除きます。保管およびさらなる使用のために、エタノール気相の上の円錐形の容器に入れます。