In vitroでの転移性コロニー形成を評価するためのメチレンブルー染色:がんマウスモデルから採取したがん細胞を定量化することにより転移を評価するための染色手順

がん転移中、原発腫瘍の腫瘍細胞は循環器系を通って移動し、遠隔臓器に血管外漏出し、二次腫瘍を確立します。

高度に転移性乳がん細胞である4T1細胞を注射した乳がんマウスモデルにおける肺転移を評価するために、採取された肺から単離された4T1細胞を含む細胞懸濁液を調製します。懸濁液を遠心分離し、6-チオグアニン、6-TG(グアニン類似体)を含む培地に細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を培養プレートに播種します。

6TGは正常細胞に入り、そこで特定のトランスフェラーゼ酵素がそれを有毒なヌクレオチドである6-TGヌクレオチドに変換します。これらの細胞傷害性ヌクレオチドはDNAに組み込まれ、DNA損傷を引き起こし、培養から細胞を選択的に排除します。4T1 細胞は有毒なヌクレオチドを形成する能力が低下しており、細胞の生存とプレートへの付着が容易になります。細胞の増殖能力に応じて、それらはコロニーを形成します。

細胞をメタノールで処理します。メタノールは細胞を透過化し、細胞タンパク質を変性させます。細胞をメチレンブルーでインキュベートします。

正に帯電した色素は細胞に入り、負に帯電したDNAと相互作用し、DNA鎖の隣接する塩基対の間の空間に挿入されます。細胞質のRNAにも結合しますが、親和性は低くなります。核は、RNA濃度が低いため、細胞質よりもDNA濃度が高いため、濃い青色に染色されます。転移性コロニーは青い点として表示されます。

プレートをイメージします。ソフトウェアを使用して転移コロニーを決定し、マウス肺の転移負荷を定量化します。

1X HBSSでチューブの容量を最大10ミリリットルにします。次に、内容物を70マイクロメートルのセルストレーナーを介して50ミリリットルの円錐形チューブに注ぎます。1ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用して、ストレーナーを通してサンプルを穏やかに粉砕します。

チューブを350倍gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。次に、ペレットを10ミリリットルの1X HBSSで2回洗浄します。ペレットを10ミリリットルの60マイクロモルの6-チオグアニン完全培地に再懸濁し、必要に応じて希釈スキームを使用してサンプルを10センチメートルの細胞培養プレートにプレーニングします。

プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で5日間インキュベートします。プレートから培地を適切な廃棄物容器に注ぎます。細胞を固定するには、各プレートに5ミリリットルの原液メタノールを加え、室温で5分間インキュベートし、プレート全体を覆うようにメタノールを旋回させます。

プレートからメタノールを適切な廃棄物容器に注ぎ、次に、各プレートを5ミリリットルの蒸留水ですすいでください。プレートあたり5ミリリットルの0.03%メチレンブルーを加え、室温で5分間インキュベートし、プレート全体を覆うようにメチレンブルー溶液を必ず旋回させます。メチレンブルーを適切な廃棄物容器に注ぎ、各プレートを5ミリリットルの蒸留水で再度すすいでください。

プレートを逆さまにし、ペーパータオルで拭き取り、余分な液体を取り除きます。プレートを蓋の上に置き、一晩自然乾燥させます。転移性コロニーは青色になります。プレートが乾燥したら、室温で無期限に保存できます。