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軟骨染色の場合は、安楽死させたマウスのホルマリン固定、パラフィン包埋軟骨切片から始めます。
まず、サンプルをキシレン代替物(パラフィンワックスを除去し、脱水組織を露出させる無害な透明化剤)に浸します。次に、サンプルをエタノール濃度を下げて処理し、その後の染色のために組織を再水和します。
次に、サンプルをWeigertの鉄ヘマトキシリン(第一鉄イオンを含む有機染色剤)で染色し、短時間インキュベートします。ヘマトキシリン分子は第一鉄イオンと錯体を形成し、細胞に浸透します。第一鉄イオンは媒染剤として作用し、ヘマトキシリンの核酸への結合を促進し、核酸に青色を与えます。
次に、サンプルを高速緑色染料(結合組織に結合して緑色を与える対比染色)で処理します。その後、サンプルを酢酸溶液で処理して色素分子を安定させます。最後に、サンプルをサフラニンオレンジ(カチオン性色素)で染色し、インキュベートします。
正に帯電したサフラニン分子は、軟骨内の負に帯電したプロテオグリカンに向かって移動し、それらに結合して赤い色を与えます。その後、スライドを樹脂媒体に取り付け、顕微鏡で視覚化します。
健康な軟骨は、プロテオグリカンが豊富な細胞外マトリックスにより非常に赤く見えますが、不健康な軟骨は、組織損傷の兆候があり、赤く見えません。
サフラニン-O染色を行うには、まずスライドをオキシレンで3〜5分間脱パラフィンし、オキシレン浴を2回繰り返します。次に、スライドをエタノール勾配で水和し、蒸留水で締めくくります。次に、スライドをワイガートの鉄ヘマトキシリン溶液、0.05%ファストグリーン溶液、1%酢酸溶液、および0.1%サフラニン-O溶液に通します。次に、樹脂媒体を使用してスライドを取り付けます。