細胞の過ヨウ素酸シッフ染色:末梢血単核細胞のグリコーゲンレベルを検出するためのIn Vitro技術

末梢血単核球 (PBMC) は、B リンパ球と T リンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、樹状細胞からなる、単一の大きな核を持つ循環血球です。PBMCは、余剰グルコースをグリコーゲン(分岐多糖類)として細胞質に貯蔵します。

PBMC中のグリコーゲンの存在を検出するには、スライドガラス上に単離されたPBMCの均一な塗抹標本を調製します。細胞生体分子を架橋する固定液であるホルマリンで細胞を処理し、PBMCの構造的完全性を維持します。

スライドをアミラーゼ溶液に部分的に浸します。この酵素は細胞に入り、処理された細胞内のグリコーゲンを加水分解します。これにより、酵素処理されたグリコーゲン欠損細胞と、アミラーゼ処理されていないグリコーゲンに富む細胞という2つの異なる細胞集団が生成されます。

グリコーゲン分子のヒドロキシル基を酸化的に変換する過ヨウ素酸溶液でそれらを重ねます。

スライドを水ですすぎ、酸化反応を止め、余分な過ヨウ素酸を除去します。スライドをシッフ試薬で処理すると、過ヨウ素酸処理されたグリコーゲンのアルデヒド基と反応し、不溶性のマゼンタ色の複合体が生成されます。

イメージング中に細胞を拘束するために、封入剤を塗布します。カバーガラスを配置して、スライド表面全体に実装メディアを広げて、視覚化を改善します。染色された細胞を画像化します。

ミラーゼ処理されていない細胞には、酵素処理された細胞には存在しないマゼンタグリコーゲン顆粒が含まれています。

このステップでは、スライドを平らな面に置きます。サンプルに2ミリリットルの過ヨウ素酸溶液を塗布し、室温で5分間インキュベートします。次に、スライドを蒸留水で数回すすいでください。スライドに2ミリリットルのシッフ試薬を塗布し、室温で15分間インキュベートします。

、スライドを蒸留水で5分間洗浄し、自然乾燥させます。次に、スライドに100マイクロリットルの封入剤を塗布し、1つの大きなカバーガラスで覆うか、50マイクロリットルを塗布して2つの小さなカバーガラスを使用します。その後、カバーガラスの端に透明なマニキュアを塗ります。一晩乾燥させます。

次に、100X対物レンズを使用して双眼光学顕微鏡で画像を取得します。