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組織切片の軟骨と骨領域を視覚化するには、目的の薄い凍結マウス胚組織切片を運ぶスライドガラスから始めます。
凍結切片を短時間解凍し、適切なエタノール濃度に浸して凍結包埋培地を除去します。除去ステップは、染色中の組織の視覚化に影響を与える可能性のある培地の緩みを防ぐのに役立ちます。さらに、エタノールは組織を固定し、組織の形態と完全性を維持します。
次に、クレシルバイオレット溶液を組織にピペットで移動させます。クレシルバイオレットは、正に帯電した塩基性色素であり、軟骨組織マトリックス内のプロテオグリカンなどのポリアニオン性部分に結合します。一方、骨などの石灰化組織では、骨基質内のリン酸基などの負に帯電した基と反応します。
異色染料であるクレシルバイオレットは、それらの領域内のさまざまな化学成分との相互作用に基づいて、組織のさまざまな領域を天然染料とは異なる色で染色します。
次に、適切なエタノール濃度で組織を洗浄して、余分な汚れを取り除きます。組織からの水分を置き換えるために、エタノール濃度を上げて組織に浸し、組織を脱水します。組織をキシレンで洗浄してエタノールを置換し、顕微鏡検査のために組織を透明にします。
光学顕微鏡下では、軟骨組織はマゼンタ色に見え、骨組織は茶色に見え、軟骨組織同士および周囲の組織との区別が容易になります。
標識された50ミリリットルの遠心分離管を3本用意します。各チューブに45ミリリットルの80%エタノールを加えます。氷の上に3本のチューブを置きます。45ミリリットルの95%エタノールと100%エタノールの入ったチューブを氷の上に置きます。次に、室温で 45 ミリリットルのキシレンを 50 ミリリットルの遠心分離管に加えます。
PENメンブレンスライドを手袋をはめた手に当てて短時間解凍し、80%エタノールを含む各チューブで攪拌しながら30秒間2回洗浄し、最適な切断温度コンパウンドを除去します。次に、スライドをアルミホイルの上に置きます。0.8 ミリリットルの 0.1% クレシル バイオレットを 50% エタノールにピペットでスライドにピペットで入れ、30 秒間染色します。
80%エタノールを含む3番目のチューブでスライドを30秒間洗浄します。スライドを95%エタノールを含むチューブに30秒間、100%エタノールを含むチューブに30秒間通し、最後にキシレンを含むチューブに30秒間通して脱水します。この後、スライドをデリケートなタスクワイパーの上に5分間置き、キシレンを排出し、セクションを乾燥させます。