ショウジョウバエ幼虫の油滴染色:BODIPYベース色素を用いた正常条件およびストレス条件下での脂肪滴蓄積評価法

ショウジョウバエの幼虫のオエノサイトは、外側表皮の基底面(皮膚の表層)に個別のクラスターの形で付着する特殊な細胞です。これらのオエノサイトは主に脂質代謝に関与しています。

飢餓中、これらのエノサイトは過剰な脂質滴を蓄積します。各液滴は、トリグリセリドやコレステロールエステルなどの中性脂質の疎水性コアで構成され、リン脂質単層で囲まれています。

脂質液滴を視覚化するには、オエノサイトが付着したショウジョウバエ幼虫表皮の解剖切片を取ります。パラホルムアルデヒドを含む固定バッファーで処理して、プロテアーゼなどの細胞タンパク質を架橋し、オエノサイトの構造的完全性を維持します。固定バッファーを取り外します。光退色を避けるために、蛍光BODIPYベースの色素と暗所でインキュベートします。

インキュベーション中、非極性色素はオエノサイトの細胞膜を横切って拡散し、脂質滴を囲む単層を通過します。色素分子の疎水性により、脂質液滴の非極性コアへの移動が可能になり、中性脂質に結合します。

標本をスライドに取り付け、オエノサイトが顕微鏡スライドに接触して、鮮明に視覚化します。カバーガラスを使用してサンプルを密封し、蛍光顕微鏡で観察します。

493ナノメートルの波長の青色光によって励起されると、色素は503ナノメートルの緑色蛍光を発します。緑色の蛍光スポットは脂質滴の存在を確認します。

脂質液滴染色の場合、解剖した表皮を固定バッファー中でローテーター上で室温で30分間インキュベートし、続いて1ミリリットルのPBSにすばやく再懸濁します。次に、洗浄ごとに1ミリリットルのPBSで5分間の洗浄を3回行行い、残留固定液を除去します。

最後の洗浄後、表皮サンプルを適切な親油性プローブとともにローテーター上で室温で30分間インキュベートします。インキュベーション中、サンプルチューブをホイルで包んで組織を光から保護し、サンプルを1ミリリットルのPBSで1回10分間洗浄1

回3回洗浄します。

オエノサイトを画像化するには、各表皮サンプルを清潔な顕微鏡スライド上の6マイクロリットルの封入剤に移します。卵細胞を含む内面がスライドの底に触れるように、組織の向きを調整します。表皮にカバーガラスをそっと置き、透明なマニキュアで端を密閉します。ポリッシュが乾いたら、適切な励起波長と発光波長で63倍の倍率で共焦点顕微鏡でサンプルを画像化します。