アミロイド沈着物のhFTAA染色:組織切片の蛍光イメージングのためのオリゴチオフェンベースの色素を用いたアミロイド線維の可視化技術

誤って折りたたまれたタンパク質凝集体の沈着 - 細胞外組織空間のアミロイドは、さまざまなプロテオパシー疾患の特徴です。これらのアミロイドは、線維軸に垂直に整列するベータシートで構成され、クロスベータシートリピートを形成します。

ヘプタマーホルミルチオフェン酢酸(hFTAA)染色でアミロイド沈着物を検出するには、アミロイド沈着物を含むホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を採取します。

切片をキシレンで処理して組織を脱パラフィン化し、後続のステップで染色へのアクセスを改善します。組織切片にhFTAA染色液を数滴加え、色素が組織に浸透するようにインキュベートします。

hFTAAには、チオフェン主格に結合した7つの共役硫黄含有チオフェンユニットと末端カルボキシル基が含まれています。これらの特徴により、結合していない染料に柔軟性がもたらされます。インキュベーション中、色素の末端カルボキシル基は、静電相互作用を介してベータシートの疎水性溝を裏打ちする正に帯電したアミノ酸残基と結合します。

その結果、結合したhFTAA色素の構造的柔軟性を低下させるコンフォメーション変化が起こります。これにより、結合色素の蛍光量子収率(吸収光子と放出光子の相対比)が向上します。このプロセスは、アミロイドの視覚化を改善するのに役立ちます。

蛍光顕微鏡でスライドを観察します。黄赤色蛍光スポットの存在は、組織切片にアミロイドが存在することを示しています。

凍結

乾燥したhFTAAを2ミリモルの水酸化ナトリウムに再懸濁し、1 mg/mLのストック溶液を調製することにより、発光共役オリゴチオフェン溶液を調製します。原液をガラスバイアルに移し、摂氏4度で保存します。

ホルマリン固定、パラフィン包埋切片を使用する場合は、キシレンで一晩脱パラフィン化します。染色当日、切片を99%エタノール、70%エタノール、dH₂O、およびPBSの連続した浴に毎回10分間浸漬します。次に、組織切片を周囲条件下で乾燥させます。

組織が乾燥している間に、ストックをPBSで1:10,000に希釈して、hFTAAの作業溶液を調製します。組織が乾いたら、hFTAA作業溶液の液滴を各組織切片に加えて覆います。室温で30分間インキュベートします。

染色液を500マイクロリットルのPBSで洗い流し、スライドをPBS浴に10分間

浸します。 常

温下で乾燥させた後、蛍光封入剤を用いて取付します。封入媒体を一晩沈殿させます。

アミロイド検出は、装着後すぐに、または装着せずに行うことができます。ただし、実験の目的が高品質のスペクトル情報を収集することである場合は、一晩のインキュベーションが好ましいです。