ラット脳組織切片のTTC染色:虚血再灌流障害後の組織切片中の生存組織と壊死組織を区別するための染色手順

脳虚血中は、脳への血流障害により組織への酸素と栄養素の供給が減少し、脳の損傷を引き起こします。短時間の虚血の後、脳への血流が回復すると、酸素供給の増加を伴う再灌流により、反応性イオン種の過剰生成が引き起こされ、虚血再灌流障害として知られる酸化組織損傷につながります。

ラットモデルにおける虚血再灌流障害後の脳損傷を評価するには、まずラットの脳を採取します。冷やした緩衝液ですすぎ、破片や血液を取り除きます。脳を切片して、所望の厚さの冠状スライスを取得します。スライスを緩衝液を含むトレイに慎重に移し、前面を上に向けて、その後の染色を行います。

水溶性酸化還元色素である温かい塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)の溶液を脳スライス上に加えます。TTCは光に敏感であるため、暗い条件下でインキュベートします。TTCは組織切片内の細胞に入ります。

生細胞では、補因子の存在下で活性ミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼ酵素が、酸化時に無色のTTCを水不溶性の赤色ホルマザンに還元し、生細胞を濃い赤色に染色します。しかし、壊死細胞はデヒドロゲナーゼ活性を欠いています。したがって、TTCは酸化された形のままであり、細胞を白く染色します。

インキュベーション後、脳スライスをイメージングトレイに移します。矢状面で半球を分離します。脳のスライスをイメージします。

健康な組織は赤く見え、損傷した組織は白く見えるため、壊死組織と生存組織を区別し、組織損傷の程度を推定できます。

脳幹を含む脳を頭蓋骨から取り除いた後、腹側を上にして脳を脳マトリックスに入れます。動物の体重に応じて、脳ステンレス鋼マトリックスの正しいサイズを選択してください。ブレードを使用して、脳の前頭部分と尾部を制限します。次に、ブレードを最初と最後のブレードの間のチャネルに部分的に入れます。

すべてのブレードが挿入され、平行に配置されたら、すべてのブレードを手のひらで同時に押し下げて、脳を2ミリメートルの冠状スライスに切断します。次に、2本の指で刃の側面に沿ってしっかりとつかみ、スライスした脳と一緒にマトリックスから取り除きます。脳のスライスをトレイに1つずつ並べ、各スライスの前面が常に上を向くようにします。

次に、温かい1%トリフェニルテトラゾリウム塩化物溶液とPBSを脳スライスに注ぎ、暗闇の中で摂氏37度で8分間インキュベートします。インキュベーション後、脳スライスを青いプラスチックトレイに移して画像をキャプチャします。脳のスライスを前頭から尾側まで順番に並べ、メスを使って矢状面の半球を分離します。