JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 3:08 分 • July 8th, 2025
破骨細胞は、骨表面に見られる大きなドーム型の多核細胞です。これらの細胞には、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ、またはTRAP(破骨細胞の波立った境界から骨組織に分泌される金属タンパク質酵素)が豊富な多数の細胞質顆粒が含まれています。この酵素は細胞外マトリックスを消化し、ミネラル結晶を溶解し、骨吸収を促進します。
破骨細胞の細胞化学的マーカーとしてTRAP顆粒を検出するには、付着破骨細胞を含む培養皿を取ります。細胞にTRAP染色液を加えます。この溶液は、基質 - リン酸塩含有ナフトール誘導体および酒石酸をジアゾニウム塩を添加した緩衝液中を含む。
この溶液に酢酸を加えて、TRAP染色に必要な酸性pHを維持します。最適なTRAP酵素活性を得るために、生理学的温度で暗所で細胞をインキュベートします。
染色液は破骨細胞に入り、酒石酸は他の細胞における酒石酸感受性酸性ホスファターゼの加水分解活性を阻害します。
同時に、TRAPは添加された基質を加水分解してリン酸基を除去します。加水分解された基質は、染色液からのジアゾニウム塩と結合して、栗色の不溶性色素複合体を形成します。この複合体は、酵素活性の部位に顆粒として沈殿します。
顕微鏡で細胞を画像化します。細胞質内の栗色色素顆粒の沈着は、培養物中にTRAP含有破骨細胞が存在することを確認します。
このステップでは、培地を吸引し、サンプルを1X PBSで3回穏やかに洗浄します。次に、96ウェルプレートの各ウェルの細胞を100マイクロリットルの固定溶液で室温で30秒間固定します。
固定後、固定液を吸引し、摂氏37度に予熱した脱イオン水で細胞を3回穏やかに洗浄します。次に、脱イオン水を吸引し、96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのTRAP染色剤を加えます。
プレートを摂氏37度のインキュベーターに30分間置き、光から遮ります。染色後、TRAP染色を吸引し、脱イオン水で3回優しく洗浄します。続いて、倒立顕微鏡で破骨細胞を40倍の倍率で画像化します。