硫酸化グリコサミノグリカンの銀染色:ポリアクリルアミドゲル中の硫酸化グリコサミノグリカンの可視化のための染色法

硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)は、異なる位置で硫酸化された繰り返し二糖単位鎖を持つ、長くて負に帯電した直鎖状多糖類であり、さまざまな長さで存在します。

電気泳動後のポリアクリルアミドゲル中の鎖長が異なる目的の単離された硫酸化GAGを視覚化するには、ゲルをカセットから慎重に取り出します。脱イオン水ですすぎ、染色を妨げる可能性のある付着したゲル片を取り除きます。

酸性アルシアンブルー溶液で処理します。酸性条件下では、中心に銅原子を持つ多価カチオン性色素であるアルシアンブルーは、イオン相互作用を介して負に帯電した硫酸化 GAG と特異的に相互作用し、濃い青色の水不溶性錯体を形成します。

ゲルを脱イオン水とメタノールで洗浄し、残留汚れを取り除きます。ゲルをアルカリ性硝酸銀溶液でインキュベートします。アルカリ性条件下では、アルシアの青色結合硫酸化GAGは、正に帯電した銀イオンが結合して錯体を形成するための部位を提供します。

ホルムアルデヒドとクエン酸を含む現像液でゲルを処理します。クエン酸はホルムアルデヒドの最適な活性のために局所的なpHを下げ、硫酸化GAGフラグメント内の銀イオンを不溶性の金属銀に還元し、アルシアンブルーシグナルを増幅します。

停止液を加えてpHを下げ、銀イオンの還元を防ぎ、バックグラウンド染色を最小限に抑えます。次に、ジェルをイメージします。

アルシャンの青銀染色硫酸化GAGフラグメントバンドは暗褐色または黒色に見え、単離されたGAGポリマー鎖長の高感度の視覚化と決定を可能にします。

実行が完了したら、カセットを分解し、脱イオン水で満たされた大きくて清潔な容器にゲルを慎重に抽出します。次に、水を捨て、ゲルをアルシアンブルー染色液で5分間染色します。アルシアンブルー染色を廃棄し、アルシアンブルー染色液の大部分が除去されるまで、脱イオンしたろ過水で2〜3回すばやく洗浄します。

ゲルを硝酸銀染色液で新鮮で清潔な容器に入れて30分間染色します。次に、脱イオンろ過水でそれぞれ30分間2〜3回洗浄し、銀染色液を完全に除去します。水を捨て、現像液を加えます。

ゲルのバンドの外観を注意深く観察します。染色の品質とロードされたサンプルの質量に応じて、現像には数秒から数分かかる場合があります。目的のバンドが見えたらすぐに、現像液をすぐに廃棄し、ゲルを停止液で短時間洗浄します。