JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 2:42 分 • July 8th, 2025
プロテオグリカンは、硫酸化グリコサミノグリカン鎖に共有結合したコアタンパク質で構成されています。
プロテオグリカンを視覚化するには、コラーゲンベースの足場(多孔質ポリマー基質)から始めて、間葉系幹細胞(MSC)懸濁液をそれらに播種します。これにより、MSC に構造的なサポートが提供され、MSC が足場の空洞の表面と内側で成長できるようになります。
MSCの成熟軟骨細胞(軟骨細胞)への形質転換を促進する形質転換成長因子を含む軟骨形成分化培地でコンストラクトを処理します。成熟した軟骨細胞は、足場内のコラーゲンとネットワークを形成するプロテオグリカンを分泌します。
軟骨細胞を含んだコンストラクトから調製されたセクションを取ります。塩酸グアニジウムを添加したアルシアンブルー染色剤の酸性溶液を加え、インキュベートします。インキュベーション中、色素溶液中の塩酸グアニジンは、より良い染色のためにプロテオグリカン凝集体を解離させます。
その後、プロテオグリカンからの負に帯電した硫酸化グリコサミノグリカンは、銅を含む正に帯電したアルシアンブルー色素分子に結合し、青色の堆積物をもたらします。
次に、塩化マグネシウムを含む脱色液にスライドを浸漬します。マグネシウムイオンは、グリコサミノグリカン上の結合部位をめぐって正に帯電した色素分子と競合するため、過剰染色が防止されます。
セクションをイメージします。青色は、サンプル中のプロテオグリカンの存在を確認します
凍結乾燥コラーゲン1型から構成されたスポンジ状の医療機器から軟骨形成分化を行うには、一辺あたり3ミリメートルの立方体をカットします。立方体の上にMSCを4 x 106細胞/mlの濃度で播種します。
細胞を室温で30分間キューブに付着させた後、テキストプロトコルに記載されているように、MSC-コラーゲン構築物を軟骨形成培地に維持します。切片に0.4%アルシアンブルー溶液を加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、40%DMSOと0.05モルの塩化マグネシウムを使用して細胞を30分間洗浄し、その後核で高速赤を使用して細胞を対比染色します。