ダブル染色法:ルテニウムレッドとラクトフェノールコットンブルーを用いた植物と真菌の相互作用を可視化する技術

コーヒーさび病では、病原性真菌であるヘミレイア・バスタトリックスの胞子が植物の表面に着地し、発芽管を成長させ、菌糸を介して感染を開始します。

これらの菌糸は組織内に広がり、吸器と呼ばれる特殊な指のような構造を介して植物細胞に侵入し、植物の栄養素を吸収します。吸器はまた、植物の耐性タンパク質によって認識されるエフェクター分子を分泌し、ペクチンが豊富な吸器をカプセル化して感染を制限します。

この相互作用を視覚化するには、極薄の樹脂が埋め込まれた感染したコーヒー葉の切片から始めます。次に、サンプルをラクトフェノールコットンブルー(フェノール、乳酸、グリセロール、コットンブルーからなる組織学的染色剤)で処理します。スライドを短時間加熱します。

色素成分が組織に浸透すると、フェノールは生きた生物を排除し、乳酸とグリセロールは細胞構造の保存に役立ちます。同時に、コットンブルーの分子は真菌細胞壁のキチン部分に結合し、それを青く染色します。

サンプルを蒸留水で洗浄します。次に、サンプルをルテニウムレッド染料で処理します。

正に帯電したルテニウム分子は、ペクチンが豊富な植物細胞壁の負に帯電した多糖類に結合し、赤く染色します。もう一度、スライドを洗浄し、顕微鏡で視覚化します。

ペクチンが豊富な植物細胞壁は赤く見え、青い真菌菌糸から伸びる青い吸器をカプセル化しています。

8センチメートルのスチールブレードを備えた回転ミクロトームを使用して、ブロックを5マイクロメートルの厚さのセクションに切断します。蒸留水で覆われたスライドガラスに切片を置き、スライドをホットプレートに移して摂氏40度で乾燥させ、スライドガラスへの切片の接着を促進します。

乾燥後、スライドガラスにブロック参照名とスライド番号をラベル付けします。ラクトフェノール中の5%コットンブルー2ミリリットルでセクションを覆い、摂氏45度のホットプレートで5分間加熱します。

蒸

留水を入れたビーカーでスライドを3回洗浄して、余分な染料を取り除きます。2ミリリットルの0.01%ルテニウムレッドを水に1分間染めます。

蒸

留水を入れたビーカーでスライドを3回洗浄して、余分な染料を取り除きます。切片の上に蒸留水を一滴垂らし、光学顕微鏡分析を行うために切片をカバーガラスで覆います。