スーダンIV染色:採取マウス大動脈弓における脂質含みアテローム性動脈硬化性プラークの染色手順

アテローム性動脈硬化症は、動脈の内層にリポタンパク質が蓄積することで発生し、プラークの蓄積、動脈の肥厚と狭窄、血流の減少

を引き起こします。

プラークは、平滑筋細胞と細胞外マトリックスを備えた線維性キャップで構成され、低密度リポタンパク質、LDL(コレステロールエステルとトリグリセリドの疎水性コアを持つ球状粒子)で構成され、リン脂質の外層に囲

まれたコアを炎症細胞とともに囲みます。

脂質が豊富なアテローム性動脈硬化性プラークを視覚化するには、採取したばかりのマウス大動脈弓を取得します。それを暗い背景でカスタマイズされたプラットフォームに転送して、広域イメージング中のコントラストを向上させます。組織の脱水を防ぐためにバッファーを追加します。

偽の背景染色を防ぐために、大動脈弓を取り巻く血管周囲脂肪組織を除去します。大動脈とその枝を内腔を縦方向に切開し、アテローム性動脈硬化性プラークの蓄積で最も内側の表面を露出させます。

開いた大動脈弓をプラットフォームに固定し、エタノールでインキュベートします。エタノールは組織から水分を置換し、タンパク質を不活性化し、組織構造を維持します。

有機溶媒に可溶化したスーダンIV染色で処理します。プラーク内では、リポタンパク質のトリグリセリドおよびコレステロールエステルに高い親和性を持つ脂溶性ジアゾ色素であるスーダンIVが有機溶媒相から移動し、LDLの脂質の疎水性コアに結合し、安定した複合体を形成します。余分な汚れはエタノールで洗い流します。

実体顕微鏡下では、染色された脂質が豊富なアテローム性動脈硬化性プラークはオレンジレッドに見えますが、プラーク以外の領域は淡く見えます。

面分析用のピン止めベッドを準備するには、パラフィンワックスフィルムのセグメントを8回折りたたんで25 x 25ミリメートルの平らな表面を作り、フィルムの周りに黒い電気絶縁テープを巻き付けて大動脈の暗い背景を作ります。

ピン止めベッドの裏側にラベルを貼り、鉛筆の芯でマウス識別番号を書き留めます。大動脈弓をピン止めベッドに移し、PBSを組織に一滴加えます。実体顕微鏡を使用して、残りの外膜周囲脂肪組織から大動脈を洗浄し、ヴァンナはさみとデュモン鉗子を使用して、大動脈を操作したり損傷したりすることなく、周囲の脂肪組織をすべて優しく剥がします。

次に、ヴァンナスハサミを大動脈内腔に導入して、内膜表面を露出させます。上行弓の外側の湾曲を遠位方向に切断し始め、腕頭動脈を含む枝を切り開き続け、下行胸部領域の背側部分を温存します。

内膜面を表示するには、小さい湾曲を切り開き、大動脈を折りたたんで開きます。マイクロカストロビエホニードルホルダーを使用して、標本を伸ばさずに、微細な昆虫ピンの鈍い端で開いたアーチをピン止めベッドに固定し、組織が所定の位置に保持されているときにピンを標本からゆっくりと曲げます。次に、ピン留めされたアーチを下向きにして、摂氏4度のPBSのペトリ皿に保管します。

スーダンIV染色の場合は、アーチを下に向けて70%エタノールのペトリ皿で検体を5分間すすぎ、その後、検体をスーダンIV作業溶液の皿に7分間移します。

インキュベーションの最後に、サンプルを80%エタノールで3分間の洗浄を2回行い、正常な内膜表面の染色を除去し、PBSで最後にすすぎ、組織を元のペトリ皿に戻します。次に、デジタルカメラに接続された実体顕微鏡で10倍の倍率で顕微鏡写真を取得し、小さな金属製の重りを使用してピン止めベッドをペトリ皿の底に保持して、PBSに沈められたピン止めアーチの画像を取得します。