陰イオン交換クロマトグラフィーベースのタンパク質精製:正味電荷に基づいて透析細菌溶解物から目的のタンパク質を単離する分離技術

透析した細菌タンパク質ライセートから目的のタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーで分離する場合は、結合バッファーを添加してライセートの粘度を下げ、クロマトグラフィーカラムの詰まりを防ぎます。

バッファー中のキレート剤は二価カチオンに結合し、プロテアーゼ活性を阻害し、タンパク質の分解を防ぎます。さらに、標的タンパク質の等電点pI(タンパク質に正味電荷がないpH)よりpHのバッファーは、過剰に負に帯電したヒドロキシルイオンをタンパク質の正に帯電したアミン基を中和させ、タンパク質の表面を負に帯電させます。

正に帯電した第四級アミン基を持つ架橋アガロースベースの固定相を含む陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを組み立てます。結合バッファーを添加して、サンプルローディング中にタンパク質相互作用を最大化するようにカラムを準備します。希釈した細菌ライセートをロードします。

負に帯電した標的タンパク質は、負に帯電したタンパク質よりもカラム内の正に帯電したグループにしっかりと結合します。

結合バッファーを実行して、結合していない正電荷を帯びたタンパク質をカラムから除去します。溶出バッファーをカラムに通し、塩濃度を徐々に上げます。塩濃度が低いと、マイナスイオンは弱く結合したタンパク質と競合してカラムに結合し、溶出を引き起こします。

その後、高塩濃度バッファーは、より長い保持時間で目的の固く結合したタンパク質を置換し、標的タンパク質を溶出させます。収集された標的タンパク質は、さらなる分析に使用できます。

一般的なメンテナンスでFPLCを開始します。カラムバッファーAIEX-AおよびAIEX-Bをバッファーバルブに接続し、陰イオン交換樹脂含有カラムをFPLCのカラムポートに接続します。それに応じて一般的なクロマトグラフィーパラメーターを調整します。

FPLCソフトウェアでAIEXプログラムを起動し、バッファAの平衡化量を選択します。続いて、サンプルをカラムにロードし、0%から100%の高塩バッファーまでの線形勾配でタンパク質を溶出します。溶出中に2ミリリットルの画分を収集します。

実行終了後に溶出した画分を分析します。