カルシウム依存性疎水性相互作用クロマトグラフィー:疎水性相互作用に基づくカルシウム結合タンパク質の精製技術

カルシウム依存性疎水性相互作用クロマトグラフィーは、サンプル中のカルシウム結合タンパク質を他の非カルシウム結合タンパク質から分離する技術です。

まず、疎水性フェニル基で誘導体化された架橋アガロースビーズのマトリックスを含む事前に組み立てられたクロマトグラフィーカラムを使用して、標的タンパク質との相互作用を促進します。非常に高濃度のカルシウムイオンを含む結合バッファーで平衡化し、その後のサンプルローディング中に樹脂とターゲットタンパク質の相互作用を最大化します。

透析したタンパク質混合物を含むサンプルを採取し、カラム平衡化用の結合バッファーで使用する同濃度の塩化カルシウムを補充します。これにより、タンパク質のカラムへの結合が最大化されます。

カルシウムイオンはライセート中の特定のタンパク質に結合し、これらのタンパク質分子にコンフォメーション変化を誘発し、疎水性領域を露出させます。

混合物をろ過して不純物と凝集体を分離し、カラムの詰まりを防ぎます。この濾液を事前に平衡化したカラムにロードします。露出した疎水性領域を持つタンパク質は、樹脂の対応する疎水性フェニル基と相互作用します。

塩含有結合バッファーを使用して洗浄し、結合していないタンパク質を除去し、後のステップでサンプルの純度を高めます。EDTA(二価キレート剤)を含む塩化カルシウムフリー溶出バッファーをカラムに通します。

EDTAがカルシウムイオンをキレート化すると、標的タンパク質と樹脂の間の疎水性相互作用が破壊されます。標的タンパク質は可動性になり、カラムから溶出します。

タンパク質精製を継続するには、タンパク質透析後に塩化カルシウムをサンプルに添加して最終濃度25ミリモルにすると、次のステップで樹脂にS100A12が結合しやすくなります。次に、注入サイズ 0.45 ミクロンのフィルターでサンプルをろ過します。

HICバッファーとサンプルを摂氏4度まで平衡化します。次に、カラムバッファー HIC-A と B とカラムをシステムに接続し、パラメーターを調整します。

1〜2カラム容量のバッファーHIC-Aでカラムを平衡化し、サンプルをロードし、UVシグナルが再びベースラインレベルに達したら「ウォッシュ非結合サンプルブロック」をロードします。

次に、カルシウムキレート剤含有バッファーEDTAで溶出を開始します。溶出中に2ミリリットルのピーク画分を回収します。