陽イオン交換クロマトグラフィー:正味表面電荷に基づいて昆虫細胞溶解物から標的組換えタンパク質を単離する技術

0 閲覧数3:33 • July 8th, 2025

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陽イオン交換クロマトグラフィーは、正味表面電荷に基づいて混合物からのタンパク質の分離を容易

にします。

昆虫細胞タンパク質ライセートから標的シグナルトランスデューサータンパク質を単離するには、他の汚染タンパク質を含む透析された標的タンパク質ライセートを取得します。塩化ナトリウム含有バッファーを添加すると、ライセートの粘度が低下し、タンパク質の溶解度が向上し、実行中のクロマトグラフィーカラムの目詰まりを防ぎます。

さらに、タンパク質の正味電荷がゼロである標的タンパク質の等電点pIを下回る緩衝液pHは、過剰な水素イオンの負カルボン酸基への結合を促進し、標的タンパク質を正電荷を帯びます。

負に帯電した基に結合した架橋アガロースビーズを含むクロマトグラフィーカラムを組み立てます。結合バッファーを添加してカラムを平衡化し、カラムとタンパク質の相互作用を最大化します。希釈したライセートを平衡化カラムにロードします。

電荷の低い汚染タンパク質よりも、正電荷の低い標的タンパク質は相互作用し、カラムの負電荷を帯びた基にしっかりと結合します。

カラムをバッファーで洗浄し、結合していない負に帯電した汚染タンパク質を除去します。その後、溶出バッファーを通過させながら、イオン強度を徐々に増やします。

イオン強度が低い場合、カラム内の負基に対する正イオンとタンパク質の間の競合は最小限に抑えられ、弱く結合し、正電荷の少ない汚染タンパク質を溶出します。しかし、イオン強度が増すと、塩イオンは密着した標的シグナルトランスデューサータンパク質と競合し、タンパク質とカラムの間の相互作用を減少させ、精製画分として溶出します。

20ミリリットルの陽イオン交換カラムを3カラム容量のバッファーGで洗浄し、次に3カラム容量のバッファーFで洗浄して調製します。次に、20ミリリットルのバッファーEを加えて、透析サンプル20ミリリットルを最終塩化ナトリウム濃度100ミリモルに希釈し、サンプルを交換カラムに適用します。

少量

のサンプルを一度にすべて希釈するのではなく、希釈したサンプルを希釈直後にカラムに塗布して、タンパク質の沈殿を制限する必要があります。

前の希釈がロードの終わりに近づいたら、新しく希釈したサンプルをカラムにロードし続けます。次に、通常は3カラム容量を必要とするバッファーFを使用して、カラムをベースライン吸光度280まで洗浄します。

バッファーFから65%バッファーGまで400ミリリットルのグラジエントでカラムからタンパク質を溶出し、溶出液を6ミリリットルの画分で回収します。グラジエントが完了したら、カラムを洗浄し続け、さらに 1.5 カラム容量の 65% バッファー G を

充填します。

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最終更新:1 8月 2026