蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー:界面活性剤の可溶化に伴う蛍光膜タンパク質の完全性を同定する技術

脂質二重層膜に固定された細菌の内在性膜タンパク質は、膜を越えた分子の輸送とシグナルの伝達を促進します。構造研究では、特定の内在性膜組換えタンパク質が融合した緑色蛍光タンパク質GFPで過剰発現されます。

界面活性剤可溶化後の組換え膜タンパク質の安定性を評価するには、GFPタグ付き内在性膜タンパク質を含む細菌膜画分を取得します。非イオン性洗剤を追加します。臨界濃度を超えると、洗剤はミセルを形成します。

ミセルは脂質膜および膜タンパク質と相互作用し、膜を可溶化し、タンパク質と界面活性剤の複合体を形成します。さらに、膜タンパク質の疎水性膜貫通領域はマスクされていないままであり、タンパク質凝集を引き起こす可能性があります。さらに、膜タンパク質の分解により遊離GFPが生じる可能性があります。

混合物を遠心分離します。界面活性剤可溶画分含有上清を回収します。

蛍光検出器に接続されたサイズ排除クロマトグラフィーカラムを組み立てます。カラムマトリックスは、広い分画範囲を定義する細孔サイズを持つアガロースビーズで構成されています。

界面

活性剤を含むバッファーでカラムを平衡化して、非特異的相互作用を最小限に抑え、タンパク質の可溶化を維持します。

可溶化した膜画分をカラムにロードします。タンパク質凝集体は最大の細孔を回避し、ビーズ間の粒子間空間を通過して移動し、最初に溶出します。より小さなタンパク質界面活性剤複合体は、ビーズのいくつかの細孔に入り、より長い経路を横切り、後で溶出します。遊離GFPはすべてのビーズ細孔に入り、最後に溶出します。蛍光検出器は溶出した画分を分析し、GFPから発出される蛍光を検出します。

凝集体が最小限で遊離GFPを有するタンパク質-界面活性剤複合体の対称蛍光ピークは、膜タンパク質可溶化に対する界面活性剤の適合性を示しています。

蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーまたはFSEC分析では、次に、毎分0.3ミリリットルの速度でフローバッファーを使用して、広い分画範囲のサイズ排除カラムを平衡化します。次に、100マイクロリットルの可溶化メンブレンサンプルを同じ流速でカラムに注入し、蛍光光学系を使用して錯覚プロファイルを監視します。