DFEベースのアフィニティークロマトグラフィー:高イオン強度ベースの溶出条件を使用して粗サンプルから2F5モノクローナル抗体を精製する技術

DFE または DsRed-2F5-エピトープは、蛍光タンパク質である DsRed と、HIV-1 エンベロープ糖タンパク質抗原のセグメントである 2F5 エピトープを含む組換え融合タンパク質です。このエピトープは、パラトープ(2F5モノクローナル抗体の相補性決定領域の領域)に対して高い親和性を持っています。

粗サンプルから2F5モノクローナル抗体を精製するには、表面に固定化されたDFEアフィニティーリガンドを含む多孔質樹脂ビーズを充填したカラムを取ります。適切な平衡バッファーでカラムをすすぎ、pH を維持し、後続のステップでサンプル成分と樹脂の間の非特異的相互作用を防ぎます。

標的2F5モノクローナル抗体を含むサンプルをカラムにロードします。徐々に、サンプル中の抗体がカラムまたは固定相を流れ始めます。

フロー中、抗体は固定相に固定化されたDFEアフィニティーリガンドと可逆的に相互作用します。これらの相互作用では、2F5抗体のパラトープは、DFEリガンド上の相補的なエピトープに特異的に結合します。

カラムを平衡化バッファーで洗浄し、カラムに非特異的に結合した望ましくないサンプルを除去します。溶出バッファーをカラムに通します。

バッファーの高いイオン強度は、DFEリガンドと2F5モノクローナル抗体の間の相互作用を不安定にします。その結果、モノクローナル抗体はカラムから画分として溶出します。

精製された抗体画分を収集し、下流のアプリケーションのために保存します。

まず、2F5を含む清澄化植物抽出物、または同じく2F5を含む好ましい細胞ベースの発現系からの上清のいずれかを100ミリリットル調製する。次に、テキストプロトコルで概説されているように、平衡化バッファーと高イオン強度溶出バッファーを調製します。クロマトグラフィーシステムをバッファーでフラッシュします。

DFEアフィニティーカラムをクロマトグラフィーシステムに取り付け、毎分1ミリリットルの流速で5CVの平衡化バッファーで平衡化します。280ナノメートルでUV吸光度を監視します。次に、清澄化した植物抽出物または上清のいずれか 80 ミリリットルを毎分 0.5 ミリリットルの流速でカラムにロードし、2 分間の接触時間を保証します。フロースルーサンプルを2ミリリットルの割合で収集し、ブレークスルー曲線を再構成します。

フロースルーサンプルは、すぐにサンプル分析が不可能な場合は、摂氏4度で保管してください。この後、6 CV の平衡化バッファーでカラムを洗浄します。洗浄の開始時、中間時、終了時にサンプルを採取します。mAb 2F5を5容量の高イオン強度溶出バッファーで溶出します。280ナノメートルのUV信号がベースラインより5ミリ吸光度単位に増加したときに、DFE画分を収集します。