ヘッドスペースガスクロマトグラフィー:ゼブラフィッシュ胚のエタノール濃度を評価する技術

揮発性有機化合物であるエタノールの濃度を分析するには、均質化されたエタノール処理されたゼブラフィッシュ胚培養上清をクロマトグラフィーバイアルに入れることから始めます。上清には、エタノールに加えて他の不揮発性有機化合物が含まれています。密封されたバイアルをクロマトグラフィーアセンブリのサンプラーユニットに入れ、適切な温度で加熱します。

加熱中、エタノールは気化して気相またはヘッドスペースに移動し、不揮発性残留物を残します。これにより、サンプラーはキャリアガスの連続的な流れにガス状エタノールを導入することができます。これは移動相として機能します。

エタノールは、液体固定相の充填床を含む予熱されたコイル状クロマトグラフィーカラムを通過します。その揮発性と極性により、移動するエタノール分子は固定相粒子に吸着し始め、固定相に分配されます。

カラム温度が高いため、エタノール分子の吸着は不安定で一時的であり、これらの分子はキャリアガスの流れに沿って徐々に脱着し、移動します。これらのエタノール分子は、カラムの長さ全体にわたって一連の吸着-脱着イベントを受けます。

、エタノールは検出チャンバーに入り、得られたクロマトグラムの曲線下面積に対応するサンプル中のエタノール濃度を測定するのに役立ちます。

50マイクロリットルに設定された2つのp200マイクロピペットを使用し、プロテアーゼカクテル溶液を1つに吸引し、水を2つ目に吸引します。次に、ガラスピペットを使用して10個の胚を1.5ミリリットルの微量遠心チューブにすばやく入れ、キャップを閉じます。テストするすべてのサンプル、コントロール、およびエタノール処理された胚に対してこのプロセスを繰り返します。

一度に1つのサンプルを操作し、キャップをすばやく開け、200マイクロリットルに設定されたp200マイクロピペットですべての残留胚培地を吸引します。50マイクロリットルの水をすばやく、しかし穏やかに加えて取り除き、次に50マイクロリットルのプロテアーゼカクテルを加え、チューブキャップを閉じます。

サンプルを室温で10分間放置してから、450マイクロリットルの5モル塩化ナトリウムをすばやく加え、チューブキャップを閉じます。10分間ボルテックスしてサンプルを均質化し、2マイクロリットルの上清をガスクロマトグラフィーバイアルに移します。バイアルをポリテトラフルオロエチレンキャップで密封します。

起動方法が完了したら、436 Current spme ethanol 2013 3 分間吸収2_5min rg 実行をロードします。分析ソフトウェアの[方法]メニューから、サンプルリスト上の各サンプルのMETH。空気、水、および5モル塩化ナトリウムプロテアーゼカクテルブランクから始めて、サンプルリストに記入します。次に、エタノール標準を0.3125〜40ミリモルの順に入力します。

ブランクの2回目のラウンドで基準に従ってください。テストするすべての均質化胚上清サンプルを、予測エタノール濃度の最低から最高順に入力し、ブランクの3回目のラウンドを入力して終了します。

ガスクロマトグラフィーバイアルをサンプルが入力された順序でオートサンプラーに追加し、10〜15分間温めます。次に、ソフトウェアを使用してサンプルの実行を開始します。すべての実行が完了したら、サンプル・リストに最終サンプルを追加し、スタンバイを実行してシャットダウン方式をアクティブにします。覚せい剤。サンプル実行中に取得したすべてのデータをバックアップします。

シャットダウン方法が完了したら、[クロマトグラムを開く]をクリックし、結果のあるフォルダーを開きます。サンプルは自動的にこのプログラムに統合されます。結果で、正しいピークが積分されていることを確認してください。すべてのサンプルが確認されたら、結果を印刷またはエクスポートします。

エタノール標準のピーク高さをグラフにプロットします。次に、傾き、Y切片、およびR2乗値を計算します。標準のY切片からサンプルのピーク高さを差し引き、この値を標準の傾きで割ることにより、各サンプルのエタノール値を取得します。

胚中のエタノール濃度を計算するには、各サンプルの希釈係数を計算し、サンプルのエタノール値にこの希釈係数を掛けます。最後に、培地エタノール値に希釈係数10を掛けて培地参照サンプルを計算します。