0 閲覧数 • 4:15 分 • July 8th, 2025
ヘパラン硫酸塩(HS)のような硫酸化グリコサミノグリカンは、細胞表面タンパク質に結合した、可変鎖長の負に帯電した直鎖状の硫酸化多糖類です。
マウス肺組織から単離された異なる長さのHSを推定するには、ゲルカセットアセンブリから始めます。触媒剤(過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミン)を含む高濃度アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液を部分的に充填します。重合を阻害する可能性のある空気との接触を防ぐために水で重ねてください。インキュベート。
触媒剤はアクリルアミド-ビサクリルアミド重合を誘導し、小細孔分解ゲルを形成します。水を捨てます。触媒剤を含む低濃度のアクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液を加えます。ゲルコームを挿入してウェルを作成します。溶液が重合し、大細孔スタッキングゲルを形成します。
電気泳動中の最適な電気伝導性を得るために、電気泳動タンクのチャンバーにランニングバッファーをロードします。
追跡色素とスクロースを含むローディングバッファーにHS混合物を溶解します。次に、この混合物と標準的なHSラダーをカセットウェルに移します。スクロースは混合物を井戸に閉じ込めます。色素は電気泳動の進行を監視するのに役立ちます。
低電圧で電気泳動を開始します。負に帯電したHSは、スタッキングゲルを横断して正に帯電したアノードに向かって移動し、細孔径の違いによりスタッキング分解ゲル界面に集中します。
電圧を上げます。小鎖 HS は分離ゲル内を高速に移動し、より遠くまで移動しますが、長鎖 HS はゲルマトリックス内に閉じ込められ、ゆっくりと移動します。
電気泳動後、ゲルを染色します。HS は別個のバンドとして現れ、小鎖 HS は長鎖 HS よりも低い位置にあります。個々の HS の長さは、HS 標準と比較することで決定できます。
まず、空のカセットをPAGEタンクに入れます。10ミリリットルの分離ゲル溶液と60マイクロリットルの新たに調製した10%過硫酸アンモニウムを15ミリリットルのチューブで混合して、分離ゲルを鋳造します。次に、10マイクロリットルのTEMEDを加えます。チューブを2〜3回ゆっくりと反転させます。
ピペットを使用して、活性化ポリアクリルアミドゲル溶液10ミリリットルをカセットにすばやく加えます。2ミリリットルの脱イオンろ過水を重ね、分離ゲルを30分間重合させます。
分離ゲルが完全に重合したら、重ねた水を捨てます。3ミリリットルのスタッキングゲル溶液と90マイクロリットルの新しく調製された10%過硫酸アンモニウムを15ミリリットルのチューブに混合してスタッキングゲルをキャストします。次に、3マイクロリットルのTEMEDを加え、チューブを2〜3回静かに反転させます。
ピペットを使用して、カセットが縁まで満たされるまで、固化した分離ゲルの上にスタッキングゲル溶液をすばやく加えます。空のポリアクリルアミドゲルカセットに付属のコームを完全に挿入し、スタッキングゲルを30分間重合させます。ゲルが重合したら、カセットの底からテープストリップを取り外し、カセットをPAGEタンクアセンブリに戻します。上部と下部のチャンバーにそれぞれの緩衝液を入れます。
乾燥グリコサミノグリカンサンプルを必要最小量の脱イオン化ろ過水に溶解し、サンプルローディングバッファーと1対1の比率で混合します。サンプルとHSオリゴ糖ラダーをゲルにロードします。
ゲルを100ボルトで5分間再実行します。次に、分離ゲル溶液のアクリルアミドの割合に応じて、200ボルトで20〜100分間実行します。