タンパク質分析のためのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動:分子量に基づいてタンパク質を分離し、可視化する技術

まず

、界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム、SDS、および還元剤であるベータメルカプトエタノールを含む変性緩衝液でタンパク質サンプルを処理します。短時間加熱します。このステップ中に、ベータ-メルカプトエタノールはジスルフィド結合を破壊し、タンパク質に折りたたまれていないコンフォメーションをもたらします。

露出した疎水性アミノ酸を持つ折り畳まれていないタンパク質は、負に帯電したSDSに結合し、均一な負の電荷を獲得します。サンプルに適切な追跡色素を追加して、リアルタイムで視覚化します。

次に、サンプルと標準分子サイズマーカーを、スタッキングゲル(低濃度の架橋アクリルアミドポリマーを含むポリアクリルアミドゲルの最上層)に存在する別々のウェルにロードします。

バッファー充填ゲル装置を電源に接続します。

電場の存在下では、負に帯電したタンパク質は陽極に向かって自由に移動し、一緒に積み重なって分離ゲル(高濃度のゲルを含む下層)に入ります。

分離ゲルでは、タンパク質は分子サイズに応じて移動し始め、小さなタンパク質は急速に移動し、最適に分離されたタンパク質バンドが得られます。その後、実行を停止し、ゲルを取り除きます。

タンパク質の塩基性アミノ酸に静電的に結合し、青色に着色する陰イオン性染料クマシーブルーでゲルを染色します。その後、ゲルを酢酸溶液で脱色して、視覚化を図ります。

ゲルを除去し、推定分子量に基づいて分離されたタンパク質を同定します。

テキスト原稿に記載されているように、2つの分離ゲルを準備します。1ミリリットルのピペットを使用してガラス板の間にゲルを注ぎ、上部の2センチメートルに混合物が付着しないようにします。分離ゲルの上に70%エタノールを加え、2つの層の間に均一な界面を作ります。

分離ゲルが重合したら、テキスト原稿の指示に従ってスタッキングゲルを調製します。次に、分離ゲルからエタノールを取り出し、スタッキングゲル溶液を加えます。気泡を入れずに、必要な数のポケットを備えたコームを慎重に挿入し、ゲルを20〜30分間重合させます。

各サンプルとタンパク質ラダーを4マイクロリットルを別々のウェルにロードします。次に、ゲルをTris-Glycineランニングバッファー中で144ボルトで室温で45分間実行します。予熱したフェアバンクス溶液Aを使用して、ロッカー上でゲルを30分間染色し、予熱したフェアバンクス溶液Dを使用して、目的の背景が得られるまでロッカー上でゲルを脱色します。