RNA分析のための変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動:蛍光標識されたリン酸化RNAオリゴヌクレオチドをそれらの非リン酸化同等物から分離する技術

まず、蛍光標識されたリン酸化および非リン酸化RNAオリゴヌクレオチドを尿素を含むローディング色素と混合したサンプルを採取します。サンプルを加熱します。

尿素(強力な変性剤)は、熱と組み合わさって二次RNA構造を変性させ、その結果、線形化および非構造化のコンフォメーションになります。次に、アクリルアミド-ビサクリルアミド溶液を尿素と混合してゲルをキャストします。

触媒であるテトラメチレンジアミンと酸化剤である過硫酸アンモニウムを添加して、その後のゲル重合を促進します。

溶液

を組み立て済みのカセット装置に注ぎます。コームを挿入し、サンプルローディング用のウェルを作成します。ゲルを重合させます。カセットをゲル装置に入れます。上部と下部のリザーバーにランニングバッファーを追加し、ゲル全体に電流の流れを維持します。櫛を取り外します。

可視化色素と混合したサンプルをウェルにロードし、ゲルを所望の電圧の電源に接続します。ゲル中の尿素により、RNA分子は線状種として移動できます。

ゲルはふるいとして機能し、負に帯電した RNA 分子が細孔を通って正極に向かって移動できるようにします。実行中、リン酸化RNAは本質的に負であり、リン酸化されていないRNAよりも速く移動します。

蛍光標識RNAを検出するためのゲルを画像化します。リン酸化されていないRNAと比較して低いバンドとして現れる、より速く移動するリン酸化RNA間の移動度の変化を観察します。

15%変性アクリルアミドゲル溶液を調製するには、22.5ミリリットルの予混合40%29:1アクリルアミド/ビスアクリルアミド溶液、6ミリリットルの10X TBE、28.8グラムの尿素、およびRNaseフリーの水を59ミリリットルに混ぜ合わせます。次に、溶液をそっとかき混ぜます。

溶液を電子レンジで20秒間加熱し、かき混ぜ、すぐに電子レンジに戻してさらに20秒間加熱します。尿素が完全に溶解するまで溶液を穏やかにかき混ぜます。ガラスビーカーを冷水を入れた浅い水浴に5分間入れ、ガラスビーカーの周囲の冷水のレベルがガラスビーカー内の溶液のレベルを超えていることを確認します。溶液が冷めたら、0.22 マイクロメートルの使い捨てろ過ユニットでろ過して脱気し、微粒子や微細な気泡を除去します。

短いガラス皿と長いガラス皿を石鹸と水で洗います。次に、各プレートに 95% エタノールをスプレーし、ガラスを拭いて水分を取り除きます。ロングプレートを箱の上に置いて、ベンチトップから持ち上げます。次に、プレートの長辺に沿って0.4ミリメートルのスペーサーを配置します。短いプレートを長いプレートの上に置き、短いプレート、長いプレート、スペーサーの端が揃っていることを確認します。次に、等間隔の金属クランプを 3 つで両側をクランプします。

24マイクロリットルのTE