二次元半変性アガロースゲル電気泳動:サイズ不均一性に基づく多形アミロイド繊維を分離する技術

アミロイド線維は、サイズの不均一性を示す、誤って折りたたまれたタンパク質の集合体です。これらの繊維は、SDSなどの陰イオン性界面活性剤に耐性があるため、2次元半変性アガロースゲル電気泳動を使用して分析できます。

まず、SDSを含む、事前に組み立てられた大きな孔径のアガロースゲルを取ります。高い気孔率により、走行中に無傷の繊維を分離できます。SDSを含むランニングバッファーでゲルを重ねます。

アミロイド線維を含む細胞溶解物をゲルにロードします。SDSの存在とサンプル加熱ステップの欠如により、界面活性剤が耐性の高いアミロイドに結合し、無傷の繊維に均一な負電荷を与える半変性条件が生まれます。

適切な電圧でゲルを最初の次元で実行します。電場は、負に帯電したアミロイドを正に帯電したアノードに向かって移動させます。

実行中、小さな繊維は大きな繊維に比べて急速に移動し、サイズの不均一性を示す塗抹標本のようなバンドパターンを形成します。

完了したら、ゲルを垂直に回転させ、2次元で実行します。この次元では、繊維は最初の実行と同じように移動し、サイズに基づいて分離します。これにより、小さな繊維が大きな繊維よりも速く移動するため、斜めの塗抹標本が作成されます。

鋭い対角線バンドの形成は、無傷だが不均一なアミロイド線維集団を確認します。

ゲルを調製するには、ガラスビーカーに200ミリリットルのTAEバッファーに2グラムのアガロース粉末を加えます。次に、ビーカーを電子レンジで加熱してアガロースを溶かします。

次に、1 ミリリットルの 20% SDS を最終濃度 0.1% まで添加します。ビーカーをそっと回します。

次に、液体アガロースを15 cm x 14 cmのゲルスラブに注ぎます。気泡を取り除くには、1ミリリットルのピペットを使用する。.次に、ジェルの上に20ウェルのコームを置きます。

次に、ゲルの右端のレーンに約60マイクログラムの全細胞ライセートを加えます。0.1%SDSを含むTAEバッファーをランニングバッファーとして使用して、ゲルを60ボルトで約4時間実行します。

ゲルを2次元で流すには、ゲルを反時計回りに90度慎重に回転させます。次に、刑務所を60ボルトで約4時間稼働させます。