PCR後のDNAアンプリコンのアガロースゲル電気泳動:マルチプレックスPCRの産物を分析し、PCR反応の成功を評価する方法

マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応、PCRから得られるDNAアンプリコン(特定の長さの増幅されたDNA断片)を分析するには、アガロースゲル電気泳動を使用して、コーム付きのキャスティングトレイを組み立てて、サンプルローディング用のウェルを作成します。

蛍

光DNA色素を添加した電気泳動バッファーに溶解した直鎖状多糖類である溶融アガロースを鋳造トレイに注ぎ、固化させます。

溶融アガロースが重合し、微細な細孔を持つ三次元ゲルを形成します。

キャストしたゲルを電気泳動タンクに入れ、櫛側を負の陰極の近くに向けます。タンクには、最適な導電率を維持するためにゲル調製に使用される電気泳動バッファーが含まれています。櫛を取り外します。

サンプルの移動を監視するためにローディング色素溶液と混合したPCR産物サンプルをウェルに移します。定義された長さのDNAラダーを1つのウェルにロードします。電気泳動を開始します。

負

のリン酸基が等間隔に配置されたDNAアンプリコンは、ウェルからゲルに向かって正の陽極に向かって移動し、大きなアンプリコンよりも短いアンプリコンの移動度が高いため、その長さに基づいて分離されます。同時に、ゲル中の陽性蛍光DNA色素は逆方向に移動し、DNAアンプリコンと結合して塩基間に挿入します。

電気泳動後、紫外線を使用してゲルを画像化します。PCRを成功させるために、色素インターカレートされたDNAアンプリコンは、予想されるアンプリコン長のラダーに最も近い離散的な蛍光バンドとして現れます。アンプリコン収量は、蛍光強度によって推定できます。

メーカーの推奨に従って、アガロースゲル粉末を1x TBEバッファーに1.5(重量/体積)パーセントに達するまで加え、加熱して溶解します。

鋳造する前に、溶解したゲル溶液を流水で短時間傾けます。ゲル溶液50マイクロリットルあたり5マイクロリットルの蛍光核酸色素を加え、混合します。

キャスティングトレイを組み立てて水平にします。サンプル数に応じてコームを追加します。ゲル溶液をキャストに注ぎ、固まるのを待ちます。

その後、ゲルを含むキャストをゲル電気泳動システムの1x TBEバッファーに浸します。5マイクロリットルのPCR産物と2マイクロリットルのローディング色素を新しいPCRストリップに混合します。5マイクロリットルの混合物をゲル内のウェルに移します。少なくとも1つの井戸を空に保存します。参考までに空のウェルに5マイクロリットルのDNAラダーを追加します。

電極を差し込み、ゲルを15センチメートルあたり110ボルトで約1時間実行します。UVベースのゲルイメージングシステムを使用して、PCRアンプリコンを表す複数のバンドの存在を確認します。