キャピラリー電気泳動:蛍光標識ポリメラーゼ連鎖反応アンプリコンの解析技術

キャピラリー電気泳動を使用してDNAフラグメントのサイズを決定するには、まずマルチウェルアッセイプレートを採取します。各ウェルには、蛍光標識された異なるサイズのPCRアンプリコン(PCRサイクル後に得られた二本鎖DNAオリゴヌクレオチド)が含まれています。

サイズの

異なる二本鎖DNA断片をいくつかウェルに追加し、サイズ標準として機能します。これらのDNA分子にはそれぞれ、簡単に識別できるように蛍光タグが付いています。

強力な変性剤であるホルムアミドをウェルに補充し、高温で加熱します。このステップによりDNAが変性し、ゲル細孔を通って容易に移動しることができる一本鎖フラグメントが形成されます。

プレートを、キャピラリーシステム内に事前に注入されたポリマーゲルを含むフラグメント分析装置ユニットに入れます。

高電圧を印加して、ウェルから陰極の細径毛細管管(負の末端)にDNAを電気動力学的に導入します。負に帯電したDNA分子は、正に帯電したアノードに向かって移動します。短いDNA鎖は、長いDNA鎖よりも摩擦力が少なく、ゲル内をより速く移動します。

エレクトロマイグレーション中、DNAはレーザービームの経路を横切り、色素が蛍光を発します。色素からの発光信号は検出器によって捕捉され、後でエレクトロフェログラム(各蛍光DNAを異なる色の個々のピークとして表すグラフ)に変換されます。

未知のDNAフラグメントピークを基準ピークと比較して、そのサイズを分析します。

PCRアンプリコンを確認したら、新しいPCRストリップまたはプレートを使用して、PCR産物を精製水で1〜10に希釈します。ボルテックスと遠心分離機を簡単に。ヒュームカップボードで作業している間、ホルムアミドと基準サイズの標準溶液からなる遠心分離管でマスターミックスを調製します。

分析するPCR産物の数に応じて、原稿に詳述されているように、試薬量を使用します。10% の余剰ボリュームを許容します。

9.5マイクロリットルを短時間ボルテックスし、利用可能なキャピラリー電気泳動システムに適したPCRプレート上の個々のウェルに分配します。次に、0.5マイクロリットルの希釈PCR産物を追加します。密封して遠心分離します。

次に、サンプルの入ったプレートをPCRサーマルサイクラーにロードし、サンプルを摂氏95度で3分間変性させてから、摂氏4度に無期限に冷却します。1,000 x g で 1 分間遠心分離します。シールを慎重に取り外し、製造元の指示に従って校正済みのキャピラリー電気泳動システムにプレートをロードします。

選択した装置に適した試薬を使用してフラグメント分析キャピラリー電気泳動を実行し、原稿の説明に従って実行条件を調整します。