Non-Reducing SDS PAGE:ジスルフィド結合多量体タンパク質複合体の解析法

多量体タンパク質は、システイン残基間の分子間共有結合ジスルフィド結合によって安定化され、構造的および機能的完全性を維持する上で重要です。

非還元PAGEによってこのような複合体を分析するには、所望の濃度のジスルフィド安定化タンパク質を採取します。非還元性サンプルバッファーを加え、サンプルを加熱します。

このバッファーには、タンパク質に全体的な負電荷を与えるSDSと、ゲル内でのタンパク質の動きを視覚化するためのトラッキング色素が含まれています。バッファーには還元剤が含まれていないため、ジスルフィド結合が損なわれず、多量体複合体が無傷のまま維持されます。

個々の複合体を、ゲル装置で事前に組み立てられた所望の割合のポリアクリルアミドゲルのウェルにロードします。既知のサイズのタンパク質ラダーを別のウェルに追加します。井戸をSDSベースのランニングバッファに沈め、装置を電源に接続します。

電流は、負に帯電したタンパク質複合体をゲルの細孔を通って陽極(正極)に向かって移動させます。タンパク質複合体は均一に負に帯電しているため、分離はサイズに基づいて行われ、マルチマーは特定の位置で顕著な高分子量バンドを形成します。

分離されたタンパク質バンドのサイズをラダーと比較します。ゲル中に低分子量バンドが存在しないことは、無傷の多量体錯体の分離が成功したことを確認しています。

25ミリモルのトリス、192ミリモルのグリシン、および0.1%重量/体積SDSを混合して、1リットルの1X Tris-グリシンランニングバッファーを調製します。次に、SDS-PAGE実行装置をセットアップします。

メーカーのプロトコルに従って16%プレキャストTGX SDS-PAGEパッケージを開き、カセットを取り外します。ウェルを裏打ちしているコームとカセットの底からテープを取り外し、ゲルを稼働装置に入れます。ウェルが液体に沈むまで、チャンバーに1Xランニングバッファーを入れます。

プラスチックピペットを使用して、ランニングバッファーでウェルを洗い流します。サンプルを10マイクロリットルの染色済み標準マーカーとともにゲルにロードします。最後に、染料の前面がゲルの底から約1センチメートルになるまで、ゲルを200ボルトで流します。