マウスの永久中大脳動脈結紮の応用

本手順の全体的な目的は、動物モデルにおいて局所脳虚血を研究することです。まず、左眼と耳基部の間の皮膚に小さな切開を加えます。次に、頬骨弓と鱗骨の接合部で開頭術を行い、中大脳動脈を露出させ、小型血管焼灼器を用いて中大脳動脈を結紮します。

最後に、皮膚を縫合して創傷を閉じます。最終的に、マウス脳の左半球に梗塞部位があることを示す結果が得られます。脳をTTC染色するか、MRIでスキャンすることで、脳卒中の可視化が可能です。

脳卒中後の脳は、タンパク質またはmRNAの発現量の測定にも利用できます。こんにちは、私はGarza Cholaです。ロチェスター大学のGale Johnsonの研究室で大学院生として活動しています。

この手法は、虚血性脳における細胞死を導くメカニズムを明らかにすることなど、脳卒中研究分野における重要な疑問への解答に役立ちます。手術の準備として、すべての手術器具、ガーゼスポンジ、および認知アプリケーターをオートクレーブで滅菌してください。手術中は手術器具を 70% ethanol に浸しておき、使用直前に滅菌ガーゼの上で自然乾燥させてください。

手術の2時間前に、作業エリアに70% ethanolをスプレーします。マウスにbuprenorphineを0.05 mg/kg投与します。この薬剤は手術直後にも再度投与し、その後、術後24時間は3〜5時間ごとに投与します。

麻酔気化器を用い、3% ISO fluorineと20% oxygenの混合ガスでマウスを麻酔します。フローメーターで酸素量を調整してください。足指または尾をピンチして、麻酔深度を確認します。

2%イソフルランを用いて麻酔レベルを維持します。マウスの眼に人工涙液を点眼し、手術中の眼への損傷に注意してください。

アニマルクリッパーを用いて、マウスを右側を下にした側臥位に置きます。左目と左耳の付け根の間の左側の領域を刈り取ります。綿棒を使用して、ベタジン溶液と70% ethanolを交互に塗布し、患部を軽くこすって洗浄します。

繰り返しが必要です。マウスを直腸プローブに接続されたヒートパッドの上に置きます。体温を37°Cに維持するため、ミネラルオイルを用いて直腸プローブを挿入します。マウスを顕微鏡の下で右側を下にした状態で配置し、テープで固定します。

ガーゼスポンジに窓を開け、細い直線鋏を用いて手術部位を覆います。左眼と左耳基部の間に垂直に切開を加えます。手術中に組織の過剰な乾燥が生じた場合は、曲型止血鉗子を使用して手術部位を開いたままにします。

綿棒を用いて滅菌PBSを塗布します。スプリングシザーで側頭筋に水平な切開を加え、ピンセットでゆっくりと牽引して、側頭筋を頭蓋骨からわずかに分離させます。曲鉗子で下顎骨を固定し、18ゲージの針を用いて、頬骨弓と鱗状骨の接合部で小さな側頭下開頭術を行います。

ボーンラン（骨用切削器具）を用いて頭蓋骨の一部を少量ずつ除去し、MCAを露出させます。この際、頬骨弓および眼窩の内容物に損傷を与えないように注意してください。小型血管焼灼器を用いてMCAの遠位端を結紮し、側頭筋を元の位置に戻して、5-0ナイロン縫合糸で縫合します。

切開部位を閉鎖し、麻酔を停止して直腸プローブを抜去します。ブプレノルフィンを2回目としてマウスの皮下に注射します。その後、37°Cに保持されていたケージにマウスを戻します。

ヒーティングパネルを使用します。術後24時間は、食欲や飲水量の低下、背中の丸まり（屈曲姿勢）、呼吸数の増加、被毛の逆立ちなど、マウスに不快感がないか注意深く観察してください。手術直後にリカバリージェルを投与してください。

手術後2〜3時間待機します。その後、ブプレノルフィンを3〜5時間おきに、最大24時間までマウスに皮下注射します。手術から24時間後、マウスを深く麻酔し、4%TTCで灌流します。

脳を取り出し、4%パラホルムアルデヒド溶液に一晩浸漬させる。翌日、脳を切片作成用のブロックに固定する。カミソリ刃を用いて、脳を1 mm厚の切片にスライスする。

スライスをミリメートルスケールの定規の横に配置します。解剖顕微鏡に接続したデジタルカメラを使用し、Image Jソフトウェアでスライスを撮影します。

ファイルメニューをクリックし、目的の写真を開きます。プログラム内の直線タブをクリックします。定規上の2つのマージンの間に直線を描いてください。

「Analyze」メニューをクリックし、「Set Scale」を選択します。既知の距離を「1」に、長さの単位を「millimeter」に設定します。「Freehand circle」タブをクリックしてください。

円を描いて対側半球を囲みます。「analyze」メニューをクリックし、「measure」を選択します。描いた円の面積を示す計算ウィンドウが表示されます。

白いストローク領域を除き、同側半球の周囲に別の円を描きます。前述の方法で面積を測定してください。新しい値が計算ウィンドウに追加されます。

1回目と2回目の値の差が、梗塞領域の面積を表します。スライス厚1 mmごとに上記の手順を繰り返すことで、各スライスにおける脳卒中領域の面積を算出します。各スライスで算出した脳卒中領域の面積を合計し、脳卒中体積を算出します。

この図は、野生型C 57 BL/6マウスにおいて永続的なMCA結紮を行った24時間後のTTC染色脳を示しています。脳梗塞部位は白色に見え、異なる倍率および角度から確認できます。ここでは、TTC染色した梗塞脳の前方から後方にかけての厚さ1mmの切片を示しています。

体積は手術の24時間後に算出した。梗塞体積は約23 cubic millimetersである。この手法は、適切に実施すれば30分で完了できる。

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