マウスの永久中大脳動脈結紮の応用

本手法の全体的な目的は、動物モデルにおいて局所脳虚血を研究することです。まず、左眼と耳基部の間の皮膚に小さな切開を加えます。次に、頬骨弓と鱗状骨の接合部で開頭術を行い、中大脳動脈を露出させた後、小型血管焼灼器を用いて中大脳動脈を結紮します。

最後に、皮膚を縫合して創傷部を閉じます。最終的に、マウス脳の左半球に梗塞部位がある結果を得ることができます。脳をTTCで染色するか、MRIでスキャンすることで、脳卒中を可視化することが可能です。

脳卒中後の脳組織は、タンパク質またはmRNAの発現量の測定にも利用できます。こんにちは、私はロチェスター大学のGale Johnson研究室の大学院生、Garza Cholaです。

この手法は、虚血脳における細胞死に至るメカニズムの解明など、脳卒中分野における重要な疑問への回答に役立ちます。手術の準備として、すべての手術器具、ガーゼスポンジ、および認知アプリケーターをオートクレーブで滅菌してください。手術中は手術器具を70% ethanolに浸しておき、使用直前に滅菌ガーゼの上で自然乾燥させてください。

手術の2時間前に、作業エリアに70% ethanolをスプレーしてください。マウスにbuprenorphineを0.05 mg/kg投与します。この薬剤は手術直後に再度投与し、その後、術後24時間は3〜5時間ごとに投与してください。

麻酔気化器を使用し、3% ISO fluorineと20% oxygenの混合ガスでマウスを麻酔します。流量計を用いてoxygen量を調整してください。足指または尾部を挟んで、麻酔深度を確認します。

2%イソフルランを用いて麻酔レベルを維持します。マウスの目に人工涙液を点眼し、手術操作中に目を傷つけないよう注意してください。

動物用バリカンを使用し、マウスを右側を下にした側臥位に置きます。左目と左耳の付け根の間の左側の領域を剃毛します。綿棒を用い、ベタジン溶液と70% eth ethanolを交互に塗布して、患部を軽くこすりながら洗浄します。

繰り返し操作が必要です。直腸プローブに接続されたヒーターパッドの上にマウスを置きます。体温を37 °Cに維持するため、ミネラルオイルを用いて直腸プローブを挿入します。顕微鏡下でマウスを右側臥位にし、テープで固定します。

ガーゼスポンジに窓状の切り込みを入れ、微細直線剪刀を用いて手術部位を覆います。左眼と左耳基部の間に垂直に切開を加えます。手術中に組織の過度な乾燥が生じた場合は、弯曲止血鉗子を使用して手術部位を開いたままにしてください。

綿棒を使用して、滅菌PBSを塗布します。スプリングシザーを用いて側頭筋に水平に切開を加え、ピンセットでゆっくりと牽引して側頭筋を頭蓋骨からわずかに分離させます。湾曲ピンセットで下顎骨を固定し、18ゲージの針を用いて、頬骨弓と鱗状骨の接合部で小さな側頭下開頭術を行います。

ボーンラン（bone run）を用いて、頭蓋骨の一部を慎重に除去し、MCA（中大脳動脈）を露出させます。この過程で、頬骨弓および眼窩内容物を損傷させないように注意してください。小型血管焼灼器を用いてMCAの遠位部を結紮し、側頭筋を元の位置に戻して、5-0ナイロン縫合糸で縫合します。

切開部位を閉鎖するため、麻酔を中止し、直腸プローブを抜去します。マウスにブプレノルフィンを2回目として皮下注射します。マウスを37 °Cに保たれたケージに戻します。

ヒーティングパネルを使用します。術後24時間は、食欲や飲水量の低下、背中の丸まり、呼吸数の増加、被毛の逆立など、マウスに不快な症状がないか注意深く観察してください。手術直後にリカバリージェルを投与してください。

手術後2〜3時間待機します。その後、最大24時間まで3〜5時間ごとにブプレノルフィンをマウスの皮下に注射します。手術から24時間後、マウスを深く麻酔し、4%TTCで灌流します。

脳を取り出し、4%パラホルムアルデヒド溶液に一晩浸漬させる。翌日、脳を切片作成用ブロックに固定する。カミソリを用いて、脳を1 mm厚の切片にスライスする。

切片をミリメートルスケールの定規の横に配置します。解剖顕微鏡に接続したデジタルカメラを用いて、Image Jソフトウェアで切片を撮影します。

ファイルメニューをクリックし、目的の写真を開きます。プログラム内の直線タブをクリックします。定規上の2つのマージンの間に直線を引きます。

「analyze」メニューをクリックし、「set scale」を選択します。既知の距離を1に、長さの単位をmillimeterに設定します。「freehand circle」タブをクリックします。

円を描いて対側半球を囲みます。「analyze」メニューをクリックし、「measure」を選択します。計算ウィンドウが表示され、描いた円の面積が示されます。

白いストローク領域を除いて、同側半球の周囲に別の円を描きます。前述と同様に面積を測定してください。新しい値が計算ウィンドウに追加されます。

1つ目と2つ目の値の差が梗塞領域を表します。スライス厚1 mmごとに上記の手順を繰り返して、各スライスの梗塞面積を算出してください。各スライスで算出した梗塞面積を合計し、梗塞体積を算出します。

この図は、野生型C 57 BL sixマウスにおいて、永続的なMCA結紮から24時間後のTTC染色を施した脳を示しています。脳梗塞部位は白色に見え、異なる倍率および角度から観察することができます。ここでは、TTC染色された脳梗塞脳の前方から後方の梗塞部位にかけて、厚さ1 mmの切片を示しています。

体積は手術の24時間後に算出されました。梗塞体積は約23立方ミリメートルです。この手法は、適切に行えば30分で完了させることができます。

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