Name: マウスの永久中大脳動脈結紮の応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶマウスの中大脳動脈結紮法による限局性脳虚血の研究手法。TTC染色やMRIで梗塞部位を可視化し、脳卒中の病態理解と治療法開発に貢献する信頼性の高い動物モデルです。

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手術手技は、もともとはジョージア医科大学の博士ウィリアムD.ヒルの研究室に買収された。また、作者は解剖のカメラの使用のためにデビッドA. RempeとランダPriftiを感謝したいと思います。この研究はNIH NS041744、NS051279、F31 NS064700とAHA 30815697Dによってサポートされていました。

このプロトコルは、研究における動物の倫理的な使用（UCAR）に捧げられたロチェスター委員会の大学により承認された。無菌技術は、プロトコル中に従うべきである。滅菌手袋とマスクを使用する必要があります。 すべての機器、材料、化学物質、およびプロトコル中に使用されるツールは、表1で説明されています。 1。術前準備<ol><li>最初の24時間、術後の期間中のすべての3から5時間後、手術直後、手術前にブプレノルフィン（0.05mg/kg）2時間で皮下マウスを注入して。 </li><li>オートクレーブですべての手術器具、ガーゼスポンジ、そして綿の先端のアプリケーターを滅菌する。使用前に滅菌ガーゼの右上に手術して空気乾燥時に70％エタノールで手術器具を保管してください。 70％エタノールで作業領域を吹き付けます。 </li><li>麻酔気化器を使用して3％イソフルラン- 20％の酸素ガスの混合物で、マウスを麻酔。流量計で酸素の量を調整します。つま先や尾のピンチ（彼らが応答しなくなるはず）で麻酔のレベルをテストします。 2％（v / v）をイソフルランで麻酔のレベルを維持する。 </li><li>マウスの目に人工涙液を適用し、手術中に目を損傷しないように注意してください。側臥位で、その右側にマウスを置きます。 </li><li>左眼と動物のバリカンを使用して、左耳の付け根の間の左側の領域を剃る。 betadine液と70％エタノール綿の先端のアプリケーターを使用し、軽く面積をこすりで交互にエリアを清め。必要に応じて繰り返します。 </li><li> 37℃で体温を維持するために直腸プローブに接続された加熱パッド℃の上にマウスを置きますミネラルオイルを使用して直腸プローブを挿入します。 </li><li>顕微鏡下で、その右側にマウスを置き、テープで固定します。ガーゼのスポンジでウィンドウを切り取り、外科領域をカバー。 </li></ol> 2。外科手術とMCAライゲーション<ol><li>左眼と素晴らしいストレートハサミを使用して、左耳の付け根の間に縦切開を加えます。外科領域を開いておくための湾曲した止血を使用してください。 </li><li>春のはさみを使って、側頭筋上に水平方向の切開を行い、少しゆっくりと鉗子で引っ張って頭蓋骨から側頭筋を分離。 </li><li>湾曲鉗子で顎骨を保持しながら18G針を用いて頬骨弓と側頭鱗骨の接合部に小さな側頭下開頭術を行います。 </li><li>骨Rongeursと頭蓋骨の小さ​​な断片を除去することによりMCAを公開。頬骨弓と眼窩内容は、このプロセス中に破損してはならない。組織の過度の乾燥は、このプロセス中に発生した場合は、綿の先端のアプリケーターで滅菌PBSを適用します。 </li><li>小血管cauterizerを使用してMCAの遠位部分をライゲーションする。 </li><li>元の位置に戻して側頭筋を置き、外科5から0ナイロン縫合糸で切開部位を閉じる。 </li><li>麻酔を中止し、直腸プローブを削除します。皮下ブプレノルフィン（0.05mg/kg）の2番目の用量でマウスに注入する。加熱パネルで37℃に保温したケージにマウスを返します。 </li><li>密接に不快感（食欲減退/水消費量、猫背の姿勢、増加した呼吸、髪をピーロは、建てられた）のための次の24時間マウスを監視する。最高24時間までブプレノルフィン皮下すべての3から5時間後に手術とマウスを注入する。この期間中に回復ゲルでマウスを提供しています。 </li></ol> 3。 TTC染色と一回拍出量の測定<ol><li>手術24時間後には、深く、マウスを麻酔transcardially 15分間、その後10分間、4％パラホルムアルデヒド溶液で使用することによりリン酸塩のTTC（w / v）の緩衝生理食塩水4％（PBS）でマウスを灌流培地流量でミニ蠕動ポンプ。脳を取り出して、一晩4％パラホルムアルデヒド溶液に入れてください。 </li><li>セクショニングのブロックに脳を置きます。かみそりの刃を使用して1mm厚のスライスに脳をスライスして。 </li><li>ミリメートル規模の定規の横のスライスを置きます。解剖顕微鏡に接続したデジタルカメラを使用してスライスを撮影する。 </li><li>画像Jソフトウェア（http://rsbweb.nih.gov/ij/）を使用して対側のサイトの総面積から同側のサイトの非梗塞領域を差し引くことにより、ストロークの領域を計算します。スライス22のストロークの領域を積み重ねることによって一回拍出量を計算します。 </li></ol> 4。画像Jソフトウェアを使用する方向<ol><li>ファイルメニューをクリックして画像Jソフトウェアで分析する画像ファイルを開きます。 </li><li>プログラムで"直線"タブをクリックします。ルーラー上の2つのマージンの間に直線を描画します。 "分析"メニューをクリックし、"セットの規模"を選択します。 1と既知の距離、mmの長さの単位を設定します。 </li><li> "フリーハンドサークル"タブをクリックします。対側半球の輪郭を円を描く。 "分析"メニューをクリックし、"尺度"を選択します。計算画面では、描画した円の面積を示すポップアップ表示されます。 </li><li>同側半球を除くストローク（白）周辺に別の円を描きます。として、ステップ4.3で示された領域を測定します。新しい値が計算ウィンドウに追加されます。 1番目と2番目の値の差は、以下の数式と同様に示される梗塞の領域を表します。 </li><li>ステップ4.2から4.4までを繰り返すことによって、各スライスのストロークの領域を計算します。各スライス（ΣAn）で計算されたストローク領域の総和を取る。これは、各スライスの厚さは1mmであるという事実を知って一回拍出量を表しています。 ΣAn個の x 1mmの（各スライスの厚さ）=ストローク量</li></ol> 5。代表的な結果： マウスで恒久的なMCAの結紮によって得られた梗塞は主に皮質です。しかし、MCAは、レンズ核線条体枝の近位に連結している場合皮質下病変を得ることができる。 MCA結紮後のストローク量が10mm ³から35mm ³ 19、23に変わる可能性があります。 MoyanovaらのTTC染色で計算されたストロークボリューム。Filianoら23のMRI画像から決定ストローク量が35mm ³に20ミリメートル³の間にある間、19は 22ミリメートル³に10ミリメートル³の間です。多分ライゲーションの正確な位置やストローク量を測定するために使用される様々な方法でこれらの違いの可能な理由。 図1では、野生型C57/BL6マウスにおけるTTC染色した脳の24時間後に永久的なMCAの結紮が表示されます。脳卒中サイトは外観（図1A、B）に白です。図1AおよびBには、さまざまな角度から梗塞部位を示しています。図2は、後に前方からTTC染色した脳卒中脳の1mm厚のスライス（図2A - G）を示しています。梗塞体積は、24時間後に手術を算出した。梗塞の体積は、〜23ミリメートル³です。 <img src="/files/ftp_upload/3039/3039fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。脳卒中サイトの表現。AB、TTC ​​は、MCAの結紮後の全脳の画像、24時間を染色した。白い部分は梗塞を表します。 <img src="/files/ftp_upload/3039/3039fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。代表的な結果。（&gt; G）、TTC染色した1mmの脳切片、MCAL 24時間後。スライスは、後に前から整列されます。白い部分は梗塞を表します。

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<li>Ortolano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+of+new+targets+for+pharmacological+intervention+in+stroke%3A+real-time+tracking+of+T-cells+in+the+ischaemic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging of new targets for pharmacological intervention in stroke: real-time tracking of T-cells in the ischaemic brain.</a> Br J Pharmacol. 159, 808-811 (2010).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

永久的なMCAのライゲーション法は再現性の高い梗塞量と利用可能な他の方法に比べて増加した術後の生存率を与える。手続きの容易さと、短い期間（〜30分）は、さらに実践的なもの。法が広く、マウスとラットの両方で使用されています。 この手法は、実体顕微鏡下低侵襲手術が必要になります。そのため、顕微鏡下で動作し、成功した開頭術を完璧に経験が不可欠です。実験が行われる前に、ラボで一貫性の梗塞を確立することをお勧めします。再現性のある結果を達成することは、まったく同じ場所でそれぞれの時間をMCAを連結することが重要です。 MCAは、皮質下梗塞を望む場合に枝をレンズ核線条体に近位連結する必要があります。動脈が完全に連結し、閉塞は永続的です。したがって、このモデルでは、MCAを経由して再灌流を許可しません。このデモに含まれていないが、ドップラープローブは、動脈の完全結紮を確認するために患部の血流を測定するために使用されている場合、それが最善です。 動脈を露出し、凝固しながらオペレータができない損傷やパンクMCAに細心の注意を払う必要があります。...

<table border="1"><tbody><tr><th> NAME </th><th>会社とカタログ番号</th></tr><tr><td> A.ソリューションと化学物質 </td><td></td></tr><tr><td>ポビドンヨード溶液、手術スクラブ</td><td> Aplicare、82から209 </td></tr><tr><td> 70％エタノール</td><td> Koptec、V1001 </td></tr><tr><td> 2,3,5塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC） </td><td>シグマ、T8877 </td></tr><tr><td> 4％パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡の科学、159SP </td></tr><tr><td> 7.4：リン酸緩衝生理食塩水、pHをバッファ</td><td>行い、研究室で滅菌。 </td></tr><tr><td>鉱油</td><td> PML Microbiologicals、R6570 </td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バトラーカンパニー、029405 </td></tr><tr><td>ブプレノルフィン（0.3mg/ml） </td><td>ホスピーラ、NDC 0409-2012-32 </td></tr><tr><td>人工涙液</td><td>バトラーカンパニー、007312 </td></tr><tr><td>リカバリージェル</td><td>明確なH 2 O、72-01-5022 </td></tr><tr><td> B.手術材料と機器 </td><td></td></tr><tr><td> 10〜12週古いC57/BL6マウス、 </td><td>コロニーは、大学のビバリウムで飼育された</td></tr><tr><td> 100％の酸素タンク</td><td> Airgasの</td></tr><tr><td>麻酔気化器と流量計</td><td> Surgivet、モデル100 </td></tr><tr><td>直腸プローブによる加熱パッド</td><td>ファイン科学ツール、TR200 </td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ツァイス、STEMI 2000 </td></tr><tr><td>暖房パネル</td><td>ペトコサービス株式会社0307-013 </td></tr><tr><td>小血管Cauterizerセット</td><td>ファイン科学ツール、18000〜00 </td></tr><tr><td>ミニ蠕動ポンプ</td><td>ハーバード装置、MPII </td></tr><tr><td> 1ミリリットルの注射器</td><td> BD、329650 </td></tr><tr><td> 18Gの針</td><td>ベクトンディッキンソン、305196 </td></tr><tr><td>外科5.0ナイロン縫合糸</td><td> Ethilon、698H </td></tr><tr><td>ブロックをセクショニング</td><td>ケントサイエンティフィック、1ミリメートル</td></tr><tr><td>単一のエッジかみそりの刃</td><td>電子顕微鏡の科学、71962 </td></tr><tr><td>ラベルテープ</td><td> Scienceware、ベルアート製品F13463 - 2075 </td></tr><tr><td>ガーゼスポンジ</td><td>ケンドールキュリティ2252、ジョンソンアンドジョンソン6415 </td></tr><tr><td>綿のヒントアプリケーター</td><td>ピューリタン806 - WCL </td></tr><tr><td> C.手術ツール </td><td></td></tr><tr><td>外科春のはさみ</td><td>ファイン科学ツール15003〜08 </td></tr><tr><td> Microdissecting鉗子は、角度</td><td>ファイン科学のツール45分の5 </td></tr><tr><td> Microdissecting鉗子の湾曲</td><td>ファイン科学ツール5のTi </td></tr><tr><td>ファインストレートはさみ</td><td>ファイン科学ツール14568〜12 </td></tr><tr><td>湾曲した骨の骨鉗子</td><td>ファイン科学ツール16021〜14 </td></tr><tr><td>ハートマンの止血剤は、湾曲した</td><td>ファイン科学ツール13003〜10 </td></tr></tbody></table> 表1。MCAのライゲーションの手続きのために使用される材料、ツール、および化学物質のリスト。 A.ソリューションと化学、B.手術材料と機器、C.外科ツール。

マウスの永久中大脳動脈結紮の応用

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

局所脳虚血は、患者に見られる脳卒中の最も一般的なタイプのひとつです。臨床的意義による虚血性傷害の間に展開するイベントを研究するために適切な動物モデルを開発するための長期の努力がなされている。これらの技術は、最も一般的なげっ歯類で、多くの異なる動物モデルを用いて一時的または永続的な、局所またはグローバル虚血モデルが含まれています。 また、文献で​​pMCAoと呼ばれる永久的なMCAのライゲーション法は、げっ歯類1-6の局所的虚血モデルとして広く使用されています。このメソッドは当​​初、田村らによりラットに記述されていた。 1981年7インチこのプロトコルでは開頭はMCAにアクセスするために使用され、近位領域は、電気凝固法によって閉塞させた。梗塞は閉塞の位置に応じて、主に皮質と時々線条体領域を含む。この手法は、今や十分に確立し、多くの研究室8-13に使用されています。この技術の早期使用は、&quot;梗塞コア&quot;と&quot;半影&quot;14から16の定義と記述につながった、とそれはしばしば潜在的な神経保護化合物10、12、13、17を評価するために使用されます。初期の研究はラットで行われたが、恒久的なMCAの結紮は、若干の修正18から20を有するマウスで正常に使用されています。 このモデルは、再現性梗塞と増加後の生存率が得られます。ヒトの虚血性脳卒中の約80％は、MCA領域21で発生するので、これは、脳卒中の研究のために非常に関連したモデルです。現在、脳卒中患者が利用できる効果的な治療の不足があるため、潜在的な薬理学的化合物をテストし、生理学的アウトカムを評価する良いモデルが必要である。このメソッドは、 生体内でも細胞内の低酸素応答のメカニズムを研究するために使用することができます。 ここで、我々は、C57/BL6マウスにおけるMCAの結紮術を紹介。我々は術前準備、MCAの結紮術および梗塞体積の定量化のための2,3,5塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）染色を説明します。

中大脳動脈（MCA）ライゲーションは、動物モデルでの局所脳虚血を研究する技術です。この方法では、中大脳動脈は開頭術によって公開されており、焼灼によって連結した。このメソッドは、非常に再現性の梗塞量と利用可能な他の方法に比べて増加した術後の生存率を与える。

局所脳虚血は、患者に見られる最も一般的な脳卒中のタイプの一つです。その臨床的重要性から、……するための長期的な取り組みが行われてきました。

本手順の全体的な目的は、動物モデルを用いて局所的脳虚血を研究することです。まず、左眼と耳の付け根の間の皮膚に小さな切開を加えます。次に、頬骨弓と鱗状骨の接合部で開頭術を行い、中大脳動脈を露出させ、小型血管焼灼器を用いて中大脳動脈を結紮します。最後に、皮膚を縫合して傷口を閉じます。最終的に、マウス脳の左半球に梗塞部位が認められる結果が得られます。脳はTTCで染色するか、あるいはMRIでスキャンすることで、脳梗塞を可視化することができます。脳卒中の脳組織は、タンパク質またはmRNAの発現解析にも利用できます。こんにちは、私はロチェスター大学のGale Johnson研究室で大学院生をしているGarza Cholaです。この手法は、虚血性脳における細胞死に至るメカニズムを解明するなど、脳卒中分野における重要な疑問への回答に役立ちます。手術の準備として、すべての手術器具、ガーゼスポンジ、および認知適用剤をオートクレーブで滅菌します。手術中は手術器具を70% ethanolに浸し、使用直前に滅菌ガーゼの上で自然乾燥させます。手術の2時間前に、作業エリアに70% ethanolをスプレーします。マウスにbuprenorphineを0.05 mg/kg投与します。薬剤は手術直後にも再度投与し、その後、術後24時間は3〜5時間ごとに投与します。麻酔蒸発器を用い、3%イソフルランと20%酸素の混合ガスでマウスを麻酔します。流量計で酸素量を調節してください。足指または尾をピンチすることで麻酔深度を確認します。2%イソフルランを用いて麻酔レベルを維持します。マウスの眼に人工涙液を点眼し、手術操作中に眼を傷つけないよう注意してください。アニマルクリッパーを使用し、マウスを右側を下にした側臥位に置きます。左眼と左耳の付け根の間の左側の領域を剃毛します。綿棒を使用して、ベタディン溶液と70% ethanolを交互に塗布し、患部を軽くこすって洗浄します。繰り返し行う必要があります。直腸プローブに接続されたヒートパッドの上にマウスを置きます。体温を 37 °C に維持するため、ミネラルオイルを使用して直腸プローブを挿入します。顕微鏡下でマウスを右側臥位にし、テープで固定します。ガーゼスポンジに窓状の切り込みを入れ、細い直線剪刀を用いて手術部位を覆います。左眼と左耳基部の間に垂直な切開を加えます。手術中に組織の過度な乾燥が生じた場合は、曲型止血鉗子を使用して手術野を確保してください。綿棒を用いて滅菌PBSを塗布します。スプリングシザーズで側頭筋に水平方向の切開を加え、ピンセットでゆっくりと牽引して側頭筋を頭蓋骨からわずかに剥離させます。湾曲ピンセットで下顎骨を保持し、18ゲージの針を用いて、頬骨弓と鱗状骨の接合部で小さな側頭下開頭術を行います。ボーンラン（骨用鉗子）を用いて頭蓋骨を少量ずつ除去し、MCAを露出させます。この際、頬骨弓および眼窩内容物を損傷させないように注意してください。小型血管焼灼器を用いてMCAの遠位部を結紮し、側頭筋を元の位置に戻して、5-0ナイロン縫合糸で縫合します。切開部位を閉鎖するため、麻酔を中止し、直腸プローブを除去します。ブプレノルフィンを2回目の用量でマウスに皮下注射します。マウスを37 °Cに保持しておいたケージに戻します。ヒーティングパネルを使用してください。その後24時間は、食欲や飲水量の減少、背中の丸まり、呼吸数の増加、被毛の逆立ちなど、マウスに不快な症状がないか注意深く観察してください。手術直後にリカバリージェルをマウスに与えてください。手術後2～3時間待機します。その後、24時間まで3～5時間ごとにブプレノルフィンをマウスに皮下注射します。手術の24時間後、マウスを深く麻酔し、4%TTCで灌流します。脳を取り出し、4%パラホルムアルデヒド溶液に一晩浸します。翌日、脳を切片作成用ブロックに固定します。カミソリ刃を用いて、脳を1 mm厚の切片にスライスします。スライスをミリメートルスケールの定規の横に配置します。解剖顕微鏡に接続したデジタルカメラを使用し、ImageJソフトウェアを用いてスライスを撮影します。ファイルメニューをクリックし、目的の写真を開きます。プログラム内の直線タブをクリックします。定規上の2つの目盛りの間に直線を描画します。「Analyze」メニューをクリックし、「Set Scale」を選択します。既知の距離（Known Distance）を1に、長さの単位（Unit of Length）をmillimeterに設定します。「Freehand Circle」タブをクリックしてください。円を描いて対側半球を囲みます。「分析」メニューをクリックし、「計測」を選択します。計算ウィンドウが表示され、描いた円の面積が示されます。白線で囲まれた領域を除き、同側半球を囲むように別の円を描きます。前述と同様の手順で面積を測定してください。新しい値が計算ウィンドウに追加されます。1回目と2回目の値の差が梗塞領域を表します。スライス厚1 mmで上記の手順を繰り返し、各スライスにおける脳梗塞面積を算出します。各スライスで算出した脳梗塞面積を合計し、脳梗塞体積を算出します。この図は、野生型C57BL/6マウスにおいて中大脳動脈（MCA）を永久結紮した24時間後のTTC染色脳を示しています。脳梗塞部位は白色に現れ、異なる倍率および角度から観察できます。ここでは、梗塞部位の前方から後方にかけて、TTC染色した脳梗塞脳の厚さ1 mmの切片を示しています。体積は手術から24時間後に算出しました。梗塞体積は約23 cubic millimetersです。この手法は、適切に行えば30分で完了させることができます。ご視聴ありがとうございました。

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