二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動:電荷と分子量に基づく複雑なタンパク質混合物中のタンパク質の分析のための分離技術

均質化された腫瘍組織に由来するタンパク質混合物の二次元ゲル電気泳動の場合は、カオトロフィー、双性イオン界面活性剤、および還元剤を含むバッファーで処理します。カオトロープと界面活性剤はタンパク質を変性させ、可溶化します。還元剤はタンパク質のジスルフィド結合を還元し、遊離チオール基を生成し、タンパク質をアンフォールディングして最適なタンパク質分解能を実現します。

処理したタンパク質混合物を固定化されたpH勾配、IPG、ストリップホルダーに移します。線形pH勾配を含むIPGストリップをアクリルアミドゲルマトリックス内に配置します。タンパク質溶液の蒸発を防ぐために鉱物油を加えます。ホルダーを等電体集束IEFシステムに移します。タンパク質溶液がストリップを再水和するのを待ちます。

一次元IEFを実行します。電流により、荷電タンパク質はpH勾配を通って反対に帯電した電極に向かって移動し、それぞれの等電点(タンパク質の正味電荷がゼロのpH)で固定化されます。

IEF後、IPGストリップをタンパク質に負電荷を与える陰イオン性界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で処理します。アルキル化剤と平衡化してタンパク質チオール基を修飾し、電気泳動中のタンパク質溶解度を確保します。

ストリップをプレキャストの小孔ポリアクリルアミド分解ゲルにロードし、溶融アガロースで固定します。チャンバーにSDSを含む電気泳動バッファーを充填します。IEFに垂直な二次元電気泳動を開始します。

負に帯電した分子量の大きいタンパク質は、小さなタンパク質よりも正に帯電したアノードに向かってゲル内をゆっくりと移動するため、サイズベースの分離が容易になります。

ジェルを染色します。タンパク質は、ゲル上の個別のスポットとして視覚化できます。

この手順を開始するには、事前に調製したタンパク質サンプル溶液250マイクロリットルを13センチメートルのIPGストリップホルダーの各スロットに追加します。18センチメートルのIPGストリップをゲル面を下にして、気泡がないように注意しながら各タンパク質サンプル溶液に置きます。次に、3〜4ミリリットルの鉱物油を加えて各IPGストリップを覆います。

次に、各 IPG ストリップ ホルダーを等電位集束システムに組み立て、尖った端をバック プレートに、四角い端をフロント プレートに取り付けます。IPGストリップを室温で18時間再ハイドレートした後、等電点集束システムでIEFパラメータを7.5時間、36,875ボルト時間の合計で設定します。

IEFの後、等電点集束システムから各IPGストリップを取り出し、不溶性ペーパータオルで余分な鉱物油を取り除きます。次に、各ストリップをラップで包み、摂氏-80度で保管します。

12%PAGEゲルを鋳造するには、二重蒸留水、1.5モルトリス塩酸緩衝液、40%アクリルアミド/ビサクリルアミド原液、10%過硫酸アンモニウム、およびTEMEDをビーカーに加えます。気泡ができないように注意しながら、ゲル溶液を穏やかに混合します。

ゲル溶液をマルチキャスティングチャンバーに、予想されるゲル高さ19センチメートルまでそっと注ぎます。すぐに、約3ミリリットルの二重蒸留水をマルチキャスティングチャンバーに加えて各分離ゲルを覆い、各ゲルを約1時間重合させます。

このステップは、高品質のSDS-PAGEゲルを調製するために非常に重要です。各ゲルの上部に同量の水をすぐに加える必要があります。

2リットルの電気泳動バッファーを調製し、電気泳動分離ユニットバッファータンクにバッファーを加えます。

集束したIPGストリップを冷凍庫から取り出した後、1ミリリットルの還元平衡緩衝液と微量のブロモフェノールブルーを含むプラスチック容器に入れ、穏やかに揺らしながら10分間平衡化します。還元平衡緩衝液を除去した後、4ミリリットルのアルキル化平衡緩衝液と微量のブロモフェノールブルーをIPGストリップに加え、穏やかに揺らしながら10分間平衡化します。

ゲル平衡中に、マルチキャスティングチャンバーを分解し、準備した分離ゲルカセットを取り外します。ジェルカセットを二重蒸留水で3回すすぎ、不溶性ペーパータオルでゲルカセットから余分な水分を取り除き、ジェルスタンダーに入れます。

これに続いて、平衡化されたIPGストリップを電気泳動バッファーですすぎ、不溶性ペーパータオルで各IPGストリップ表面の余分な液体を取り除きます。IPGストリップを分離SDS-PAGEゲルの上に置き、IPGストリップのプラスチック面が長いガラス板に接触し、尖った端が左になるようにします。

次に、3〜4ミリリットルのホット1%アガロースとSDS電気泳動バッファーをすばやく追加して、各SDS-PAGEゲルの上部にIPGストリップを密封し、IPGストリップの上面を短いガラス板の上部に置き、気泡を避けるように注意します。

これらの手順は、IPGストリップをSDS-PAGEゲルにシールするために非常に重要です。ホットアガロース溶液を直ちに添加し、IPGストリップをSDSゲルの上部に直ちに配置する必要があります。

重合後、組み立てたゲルカセットをプラスチックガスケットと垂直電気泳動システムの間に垂直に挿入します。IPGストリップでゲルの上部をカソードの隣に置きます。次に、電気泳動システムに適切な量のバッファーを追加して、ゲルカセットを浸漬するように電気泳動バッファーのレベルを調整します。

電源を接続して定電圧モードに設定し、染料を監視しながら200ボルトで約370分間動作させます。実行が完了したら、ゲルカセットを電気泳動システムから取り出し、ゲルが破れないように注意しながら、ゲルカセットからゲルをそっと取り出します。