二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動:電荷と分子量に基づく複雑なタンパク質混合物中のタンパク質の分析のための分離技術

均質化された腫瘍組織に由来するタンパク質混合物の二次元ゲル電気泳動の場合は、カオトロフィー、双性イオン界面活性剤、および還元剤を含むバッファーで処理します。カオトロープと界面活性剤はタンパク質を変性させ、可溶化します。還元剤はタンパク質のジスルフィド結合を還元し、遊離チオール基を生成し、タンパク質をアンフォールディングして最適なタンパク質分解能を実現します。

処理したタンパク質混合物を固定化されたpH勾配、IPG、ストリップホルダーに移します。線形pH勾配を含むIPGストリップをアクリルアミドゲルマトリックス内に配置します。タンパク質溶液の蒸発を防ぐために鉱物油を加えます。ホルダーを等電体集束IEFシステムに移します。タンパク質溶液がストリップを再水和するのを待ちます。

一次元IEFを実行します。電流により、荷電タンパク質はpH勾配を通って反対に帯電した電極に向かって移動し、それぞれの等電点(タンパク質の正味電荷がゼロのpH)で固定化されます。

IEF後、IPGストリップをタンパク質に負電荷を与える陰イオン性界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で処理します。アルキル化剤と平衡化してタンパク質チオール基を修飾し、電気泳動中のタンパク質溶解度を確保します。

ストリップをプレキャストの小孔ポリアクリルアミド分解ゲルにロードし、溶融アガロースで固定します。チャンバーにSDSを含む電気泳動バッファーを充填します。IEFに垂直な二次元電気泳動を開始します。

負に帯電した分子量の大きいタンパク質は、小さなタンパク質よりも正に帯電したアノードに向かってゲル内をゆっくりと移動するため、サイズベースの分離が容易になります。

ジェルを染色します。タンパク質は、ゲル上の個別のスポットとして視覚化できます。

この手順を開始するには、事前に調製したタンパク質サンプル溶液250マイクロリットルを13センチメートルのIPGストリップホルダーの各スロットに追加します。18センチメートルのIPGストリップをゲル面を下にして、気泡がないように注意しながら各タンパク質サンプル溶液に置きます。次に、3〜4ミリリットルの鉱物油を加えて各IPGストリップを覆います。

次に、各 IPG ストリップ ホルダーを等電位集束システムに組み立て、尖った端をバック プレートに、四角い端をフロント プレートに取り付けます。IPGストリップを室温で18時間再ハイドレートした後、等電点集束システムでIEFパラメータを7.5時間、36,875ボルト時間の合計で設定します。

IEFの後、等電点集束システムから各IPGストリップを取り出し、不溶性ペーパータオルで余分な鉱物油を取り除きます。次に、各ストリップをラップで包み、摂氏-80度で保管します。

12%PAGEゲルを鋳造するには、二重蒸留水、1.5モルトリス塩酸