Multianalyte Immunobead Assay:ヒト血清サンプル中の複数の抗体サブタイプを同時に検出するためのフローベースのイムノアッセイ技術

マルチアナライト免疫ビーズアッセイは、複数の抗原でコーティングされたマイクロスフェアを使用して、対応する標的抗体を同時に認識します。

このアッセイを開始するには、適切なバッファーを含むチューブにマイクロビーズの混合物を取ります。各ビーズの表面には特定の抗原がコーティングされており、ビーズ同士の区別が容易です。

コーティングされたイムノビーズ混合物をマイクロタイターアッセイプレートのウェルにピペットで入れます。標的抗体の異なるアイソタイプを含む血清サンプルをウェルに補充します。これらの変異体は構造に微妙な違いがあり、各ウェルが複数の一次抗体を持つことができます。

キュベートして、サンプル抗体アイソタイプがそれぞれの免疫ビーズに捕捉された特定の抗原に結合できるようにします。アッセイバッファーで洗浄して、結合していない一次抗体を除去します。一次抗体の各変異体に対応する蛍光色素タグ付き二次抗体をウェルに加えます。

標識された各二次抗体は、それぞれの一次抗体のFc部位に結合します。複数のビーズで捕捉された抗原-一次抗体複合体を蛍光標識します。プレートを洗浄して、結合していない二次抗体を除去します。

それぞれの波長で異なる蛍光色素を同時に検出できる蛍光分析装置を使用してプレートを読み取ります。シグナル検出に応じて、血清抗体のさまざまなアイソタイプとさまざまな抗原への結合を評価できます。

アッセイ性能のために、結合したマイクロスフェアをボルテックスで30秒間再懸濁し、60〜90秒間超音波処理します。次に、必要な量の各ビーズコロイドをそれぞれのチューブから取り出し、ビーズコロイドを新しい1.5ミリメートルの微量遠心チューブに結合します。

次に、チューブを磁気分離器に挿入し、60秒間分離します。チューブを磁気分離器に入れたまま、ビーズペレットを乱さずに上清を取り除きます。

ズをセパレーターから取り出した後、ビーズを100マイクロリットルのアッセイバッファーに再懸濁します。チューブを磁気分離器に60秒間入れてビーズを分離する前に、30秒間ボルテックスします。洗濯を2回繰り返します。

次に、適切な量のアッセイバッファーを添加して3プレックス作業ミクロスフェア混合物の濃度を調整し、各ターゲットに対して1 μLあたり100マイクロスフェアの最終濃度を生成します。

25マイクロリットルのマイクロスフェア混合物を96ウェルプレートの各ウェルに分注します。血漿または血清検体をアッセイバッファーで500倍に希釈し、所望の滴定に従って標準検体を調製します。

ブランクサンプルとして25マイクロリットルのアッセイバッファーを加え、希釈した検体または標準試料をそれぞれ96ウェル検体プレートの指定された各ウェルに加えます。完了したら、プレートをアルミニウムシールまたはホイルで覆い、毎分700回転に設定されたプレートシェーカーで室温で1時間インキュベートします。

原稿に記載されているように、抗ヒト検出抗体または二次抗体溶液をアッセイバッファーを含む4 μg/mLで調製します。プレートを磁気セパレーターの上に置いて急速に洗浄し、バイオハザード容器の上にプレートを強制的に反転させてウェルから液体を取り除きます。プレートを逆さまにしたまま、厚い紙の束にプレートを力強く叩きます。

次に、各ウェルを100マイクロリットルのアッセイバッファーで洗浄し、バイオハザード容器上で強制的に反転させて液体を除去します。洗浄を2回繰り返します。最後の洗浄後、使用済みの紙の束をすべてバイオハザード容器に捨てます。

次に、25マイクロリットルの二次抗体作業溶液を96ウェルプレートの各ウェルに加え、プレートをアルミホイルで覆い、プレートシェーカー上で毎分700回転でインキュベートします。

30分間のインキュベーション後、前述のように、プレートのウェルをアッセイバッファーで2回洗浄します。次に、100マイクロリットルのアッセイバッファーを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。プレートをアルミホイルで覆い、室温のプレートシェーカーで5分間インキュベートします。

システムマニュアルに従って、機器分析装置を介して60マイクロリットルのサンプルを分析します。