リング状マイクロパターニング細胞キラリティアッセイ:リング状マイクロパターン上の細胞アラインメントに基づく多細胞キラリティーを決定するIn vitro技術

in vitro哺乳類細胞のキラリティ(閉じ込められた条件下で左向きまたは右向きに整列する細胞の左右バイアス)を決定するには、培地を含むマルチウェルプレートでカスタムメイドされた金コーティングされたスライドから始めます。スライドは、細胞接着促進フィブロネクチンのリング状の島のマイクロパターンで構成され、細胞接着抵抗性の自己組織化単層で埋め戻されます。

次に、適切な量の哺乳類細胞懸濁液をスライドに播種し、インキュベートします。細胞はフィブロネクチンを含むリングマイクロパターンに吸着します。周囲の自己組織化単層は、リング境界の外側に非特異的な細胞が付着するのを防ぎます。

メディアを交換し、未接続の細胞をすべて取り除き、新しいメディアと交換します。アクチン妨害薬を1セットのスライドに加え、インキュベートします。

接着した細胞は増殖し、広がり、下にあるフィブロネクチン島の形状をとると同時に、細胞単層を閉じ込める空間的手がかりに応答してアクチン線維を再編成し、偏った整列を促進します。

次に、細胞固定のためにスライドをパラホルムアルデヒドで処理します。位相差顕微鏡下では、リングマイクロパターン上の細胞は、優先バイアスに従って整列された明るい輪郭を持つ暗い領域として現れます。

ソフトウェアを使用して、各セルの位置合わせ角度をリングの円周方向からの偏差として計算します。哺乳類細胞のキラリティを決定するための平均。アクチン干渉薬物処理細胞は逆キラリティを示すことがあります。

細胞を播種する前に、培地とトリプシンを摂氏37度で焼き戻した水浴で温めます。

細胞の付着を改善するために、パターン化されたスライドを培地を含む12ウェルプレートに浸し、インキュベーターで摂氏37度で温めます。細胞がトリプシン化されたら、FBS含有培地で細胞を中和します。細胞を100 x g で3分間ペレットダウンし、次に、細胞ペレットを新鮮な培地に再懸濁します。細胞を数え、細胞懸濁液を希釈して、ミリリットルあたり200,000細胞の濃度を達成します。

金スライドを含む各ウェルに0.5ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。プレートを数回軽く振って均一な細胞播種をし、細胞付着のために15分間インキュベートします。15分後、顕微鏡で細胞の付着を確認し、必要に応じてさらにしばらくインキュベートします。

細胞が結合したら、各ウェルから未結合の細胞を含む培地を吸引し、1ミリリットルの新鮮な培地を加えます。細胞をインキュベーターで24時間培養し、コンフルエンシーをチェックしてキラリティが形成されたかどうかを判断します。

必要なコンフルエントが達成されたら、培地を取り除いて細胞を固定します。PBSで1回すすぎた後、スライドに4%パラホルムアルデヒド溶液を加え、室温で15分間インキュベートしてから、PBSで再度3回すすぎます。

画像を取得するには、カメラ機能を備えた位相差顕微鏡を使用し、スライド上の各リングを高解像度でキャプチャします。

キラリティの特性評価については、MATLAB コード ファイルをダウンロードします。コード フォルダーとサブフォルダーを MATLAB パスに追加し、"ROI_selection.m" ファイルを開きます。4行目で、ディレクトリを目的のデータフォルダに変更します。

14行目の画像サイズを変更し、最初の2つの図はリングの内側の円のサイズを表し、他の2つの図は外側を表します。

位相差画像の関心領域または ROI を決定するには、[実行] ボタンをクリックして MATLAB コード "ROI_selection.m" m を実行します。リングに合わせて選択範囲の正方形を手動でドラッグし、画像をダブルクリックして選択を確定します。

フォルダ内のすべての画像からROIを選択すると、各画像のROI情報を格納する「.mat」ファイルが生成されます。次に、「Analysis_batch.m」ファイルを開き、前に示したようにフォルダーのディレクトリを変更します。[実行]ボタンをクリックしてコード「Analysis_batch.m」を実行し、複数のセルラーリングパターンのキラリティを決定します。

各リングの循環統計と、時計回り、非キラル、反時計回りのリングの数を含む「datatoexcel.txt」ファイルが生成されます。