細胞外小胞取り込みアッセイ:3D蛍光イメージング技術を使用して細胞外小胞の細胞取り込みを可視化および定量化する方法

細胞コミュニケーションを促進するために、細胞は細胞外小胞、EV(脂質膜で囲まれたナノサイズの構造)を分泌します。EV は、高分子や代謝産物などのさまざまな生物学的貨物を運び、レシピエント細胞に送達します。

共焦点顕微鏡を使用して細胞によるEV取り込みを視覚化するには、まず、新たに単離されたEVを採取します。これらのEVは、蛍光プローブに結合した抗体で事前に標識されており、その後簡単に視覚化できます。

接着したレシピエント細胞培養物に適切な量の蛍光標識EVを追加します。希望の期間インキュベートします。インキュベーション中、標識されたEVの亜集団が細胞表面に表面的に付着し、他のEVは内在化されます。

細胞細胞質を標識するために別の蛍光色素を追加し、内在化されたEVとレシピエント細胞に付着したEVを区別するのに役立ちます。細胞を共焦点顕微鏡下に置き、Z軸に沿って異なる焦点面で画像化し、サンプルの厚さ全体に一連の光学切片を取得します。

この光学セクションのコレクション(Zスタック)をコンパイルして、高解像度の3次元サンプル画像を形成します。仮想レンダリング(イメージング後のプロセス)を適用して、細胞表面を再構築します。

表面的に付着したEVと内面化されたEVを区別するには、それらを異なる色合いのドットとしてレンダリングします。細胞体積とそれらによって内在化されたEVの数を計算し、細胞あたりのEV取り込みを定量化します。

4 x 10⁴ PC3細胞を1ミリリットル培地で35ミリリットルの皿に播種します。最適な細胞培養条件で細胞を一晩接着させます。翌日、接着した細胞をエクソソーム枯渇培地で2回洗浄します。

蛍光標識EVをエキソソーム枯渇培地を用いて適切な濃度に希釈した後、希釈したEVを接着した標的細胞に加え、所望の実験時間インキュベートする。エクソソームフリー培地で細胞を3回洗浄して内在化していないEVを除去した後、接着した細胞の細胞質を1μg/mLのCMTMRで標識し、最適な細胞培養条件でインキュベートします。

生細胞イメージングの場合は、調製した細胞をオンステージインキュベーターに入れます。コントロールサンプルに基づいてイメージングパラメータを設定した後、ターゲット細胞の深さとz方向のスタッキングサイズの範囲を決定して、3D共焦点画像を取得します。次に、画像取得を、細胞特異的色素とEV特異的色素の両方の複数のzスタック画像に同時に設定します。

画像処理には、自動画像処理ソフトウェアを活用します。

セルの仮想サーフェスを構築するには、「新しいサーフェスを追加」をクリックします。仮想セルサーフェスを構成するには、[+ 追加] ボタンをクリックし、[フィルターの種類] として [品質] を選択します。目視検査で下限の適切な値を閾値にしきい値し、上限の最大値を設定し、「完了