ウイルス様粒子捕捉アッセイ:中和抗体標識磁気ビーズを用いて試料から抗原表示VLPを単離する方法

中和抗体 (NAb) は、侵入するウイルスから細胞を保護するために細胞から分泌されます。

NAbとウイルスとの相互作用を研究するには、人工ウイルス様粒子(VLP)を使用します。これらのナノサイズの構造には、ウイルスの遺伝物質を含まないウイルス由来タンパク質の集合体が含まれているため、非感染性です。VLPは、抗原エンベロープ糖タンパク質が埋め込まれた脂質二重層に囲まれており、NAbが結合する特殊な領域である中和エピトープを示します。

タンパク質結合磁気ビーズに結合した中和抗体を含むチューブにVLPを加えます。ビーズが沈殿しないように撹拌下でインキュベートします。インキュベーション中、VLPのエピトープ領域はNAbのFab領域の相補的なパラトープを認識し、抗原抗体複合体をもたらします。これにより、磁気ビーズがVLPを捕捉するのに役立ちます。

強力な磁石を備えた分離ラックにチューブを置きます。磁場の影響下で、VLPと複合体を形成したビーズは、抗原と抗体の相互作用を妨げることなく磁石に向かって移動します。このステップでは、結合したVLPが捕捉されますが、特定の抗原を欠いているVLPは上清に残ります。

上清を廃棄し、ペレットを洗浄バッファーで洗浄して、結合していないVLPを除去します。VLPビーズ複合体を溶出バッファーに再懸濁すると、VLPがビーズから剥離し、上清に現れます。

単離された抗原表示VLPを新しいチューブに吸引し、さらなる分析のために冷蔵

保存します。 まず

、ピペッティングを上下にピペッティングするか、回転器で50RPMで少なくとも5分間混合して、磁気ビーズを再懸濁します。

そ

の間に、bNAbを含む抗体溶液を調製します。反応ごとに10マイクログラムの各bNAbと200マイクロリットルの抗体結合および洗浄バッファーを使用します。反応ごとに、50マイクロリットルの磁気ビーズ溶液を1.5ミリリットルの反応チューブに移し、チューブを磁気分離ラックに置きます。

ビーズがチューブ壁に集まるまで待って、すべてのビーズが集まっていることを確認してから、上清を取り除きます。磁石を取り外し、事前に調製したbNAb溶液の200マイクロリットルにビーズを懸濁します。

室温で50 RPMで回転器で混合しながら、30分から3時間インキュベートします。インキュベーション後、反応チューブを磁気分離ラックに入れ、待ってから上清を取り除きます。

磁石からチューブを取り外し、200マイクロリットルの抗体結合および洗浄バッファーに再懸濁してビーズを洗浄します。抗体結合バッファーと洗浄バッファーで洗浄を繰り返し、終了したらできるだけ多くの洗浄バッファーを除去します。

ビーズ結合したbNAbにサンプルを追加します。添加されたサンプル量が1ミリリットル未満の場合は、PBSを加えてサンプル量を1ミリリット