バソフェナントロリンスルホン酸ベースの比色分析法:マウス肝臓組織中の非ヘム鉄の定量のための簡単で迅速な方法

組織内では、さまざまな代謝プロセスに不可欠な必須ミネラルである鉄は、通常、ヘモタンパク質と非ヘム鉄タンパク質に隔離されて存在します。ヘモタンパク質には、ポルフィリン環に結合した第一鉄またはヘム鉄が含まれますが、非ヘム鉄タンパク質はポルフィリン環構造を欠いており、ほとんどが第二鉄または非ヘム鉄で構成されています。

マウス肝組織中の非ヘム鉄含有量を推定するには、乾燥して採取したマウス肝組織断片を低濃度の塩酸およびトリクロロ酢酸で処理します。高温でインキュベートして組織を消化し、酸によるタンパク質沈殿を促進します。

酸濃度が低いため、非ヘム鉄は関連タンパク質から放出されます。ヘム鉄はポルフィリン環に結合しており、影響を受けません。

冷却後、非ヘム鉄を含む所望の量の上清をマルチウェルプレートに移します。還元剤であるチオグリコール酸を添加した発色鉄キレート剤、バトフェナントロリンスルホン酸、BPSを適切な緩衝液に加え、インキュベートします。

チオグリコール酸は、すべての第二鉄非ヘム鉄を第一鉄に還元し、BPS に 1:3 の比率で容易に結合し、非常に安定したピンク色の複合体を形成します。さらに、チオグリコール酸は、BPS と相互作用する可能性のある銅などの汚染二価金属カチオンによる干渉を防ぎます。

マルチウェルプレートをマイクロプレートリーダーに入れて、マウス肝組織断片中の非ヘム鉄濃度を表すピンク色の鉄-BPS複合体の吸光度を測定します。

乾燥

した各組織片を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。1ミリリットルの酸混合物をチューブに加え、閉じます。ここで組織が省略されていることを除いて、同じ方法で酸ブランクを準備します。

チューブを摂氏65度で20時間インキュベートして、組織を消化します。

室温まで冷却した後、プラスチックチップが取り付けられたマイクロピペットを使用して、500マイクロリットルの透明酸抽出物を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

発

色原反応を平底の96ウェル透明な未処理のポリスチレンマイクロプレートに直接調製します。室温で15分間インキュベートします。

プレートリーダーで、脱イオン水基準に対して535ナノメートルの波長でサンプル吸光度を測定します。