Resorption Pit Assay:リン酸カルシウムコーティング培養プレートを使用して成熟破骨細胞のカルシウム吸収活性を定量化するIn Vitro技術

破骨細胞、多核マクロファージは、骨吸収、つまり骨組織の分解と骨ミネラルの放出を促進します。

骨細胞吸収をin vitroで定量化するには、破骨細胞前駆細胞への分化と付着のための培地を含むマクロファージコロニー刺激因子M-CSFでヒト末梢血単核細胞を培養します。破骨細胞の前駆細胞を採取し、遠心分離します。

M-CSFと核因子カッパ-Βリガンドの受容体活性化因子であるRANKLを添加した培地中の再懸濁細胞懸濁液を、無機骨成分を模倣してリン酸カルシウムでコーティングされたマルチウェルプレートウェルにピペットで入れます。M-CSFとRANKLは破骨細胞前駆細胞の分化と破骨細胞への融合を引き起こし、吸収を活性化します。

活性化された破骨細胞はリン酸カルシウムコーティングに付着し、細胞骨格を再編成してアクチンに富むシーリングゾーンを形成し、プロトンと酸性加水分解酵素を分泌するフリル状の境界を形成します。結果として生じる酸性環境はリン酸カルシウムコーティングを溶解し、カルシウムイオンとリン酸イオンを放出し、吸収ピットを形成します。

インキュベーション後、ウェルを洗浄し、溶解したイオンを除去します。その後の染色のために破骨細胞を固定し、透過化します。アクチンフィラメントを適切な染料で染色します。DNA結合色素で核を対比染色します。カルシウム結合染料でウェルコーティングのカルシウムを染色します。

蛍光顕微鏡下では、機能的破骨細胞は吸収機能に重要な複数の蛍光核とアクチン環を示します。吸収ピットは、アクチン環で覆われた蛍光リン酸カルシウムコーティング上の黒い領域として現れます。

適切なソフトウェアを使用して、ピット面積を定量化し、破骨細胞吸収を決定します。

20 ng / mLマクロファージコロニー刺激因子を含む完全なα-MEMにPBMCを再懸濁し、フラスコに2.5 x 10⁵細胞/ cm² PBMCを播種します。リン酸カルシウムでコーティングされたプレートを50マイクロリットルのウシ胎児血清と摂氏37度で1時間インキュベートします。

次に、フラスコをPBSで2回洗浄して、破骨細胞前駆体を死細胞または非接着細胞から切り離します。次に、75 cm²フラスコあたり4ミリリットルのトリプシンを加えます。30分後、4ミリリットルの完全α-MEMを加えて消化を停止します。次に、セルスクレーパーを使用してセルを慎重に切り離します。

細胞を50ミリリットルのチューブに移し、計数チャンバーを使用して細胞の総数をカウントします。チューブを350 x g で7分間遠心分離して細胞をペレット化し、ペレットをM-CSFおよびRANKLを含む完全なα-MEMに再懸濁して、1 x 10⁶細胞/ mLを取得します。

リン酸カルシウムでコーティングされたプレートからウシ胎児血清を吸引し、ウェルあたり200マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットで取ります。インキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄します。細胞を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、PBSで再度洗浄します。

染色のために、固定細胞に透過処理バッファーを加え、5分間インキュベートします。

アクチンフィラメントを染色するには、細胞を100マイクロリットルのAlexaFluor 546標識ファロイジン溶液とPBS中で30分間インキュベートします。次に、染色液を吸引し、100マイクロリットルのヘクストを使用して核を10分間染色します。

酸カルシウムコーティングを100マイクロリットルの10マイクロモルカルセインでPBS中で10分間染色します。PBSで3回洗浄した後、画像をキャプチャします。