タンパク質リン酸化分析のための単一分子プルダウンアッセイ:細胞溶解物中のタンパク質リン酸化を定量するハイスループット技術

特定の細胞タンパク質のリン酸化は、その生物学的機能にとって重要です。

単一分子プルダウンアッセイを使用してインタクトタンパク質のリン酸化レベルを定量するには、まずグリッドアレイパターンのガラスカバーガラスを採取します。各コンパートメントは、タンパク質結合中の立体障害を防ぐために、通常のPEGと間隔をあけたビオチン化ポリエチレングリコールまたはPEGベースのリンカーでコーティングされています。

カバーガラスを還元試薬で処理して、分析における自家蛍光を最小限に抑えます。カバーガラスにニュートラビジン(ビオチン結合タンパク質)を重ねてインキュベートし、ビオチン化PEGリンカーに結合させます。

アレイに特異的な抗標的タンパク質抗体を補充します。各抗体には、そのFc領域に結合したビオチンが含まれており、抗体をニュートラビジンに固定し、固定化を引き起こします。

次に、標的タンパク質の緑色蛍光タグ付きリン酸化および非リン酸化バリアントを含む、さまざまなタンパク質を含む細胞培養ライセートを加え、インキュベートします。標的タンパク質の両方の変異体が抗体に捕捉され、複合体を形成します。結合していないタンパク質を洗浄して除去します。

次に、これらの複合体を、タンパク質のリン酸化残基に排他的に結合し、複合体に異なる蛍光シグナルを与える赤色蛍光タグ付き抗体の2番目のセットで処理します。

蛍光顕微鏡でアレイを画像化し、2つの異なる蛍光シグナルを観察します。両方の蛍光シグナルの共局在は、サンプル中にリン酸化タンパク質が存在することを示しています。

ビオチン-PEG官能化アレイを冷凍庫から取り出し、室温まで平衡化します。アレイを上に向けてカバーガラスを、シーリングフィルムで裏打ちされた100 mmの組織培養皿の上に置きます。アレイの各正方形を1ミリリットルあたり10ミリグラムの水素化ホウ素ナトリウムおよびPBSと室温で4分間インキュベートします。PBSで3回洗浄します。

次に、1ミリリットルあたり0.2ミリグラムのNeutrAvidinをT50中で5分間インキュベートし、続いてT50-BSAで3回洗浄します。T50-BSA中で1ミリリットルあたり2マイクログラムのビオチン化POI特異的抗体で10分間インキュベーションを繰り返し、続いて洗浄します。

まず、ピペッティングで溶解液を解凍し、混合します。1マイクロリットルのライセートを100マイクロリットルの氷冷T50-BSA / PPIに希釈します。ライセートをアレイ上で10分間インキュベートし、その後洗浄します。AF647 結合抗ホスホチロシン抗体を氷冷の T50-BSA/PPI 中で調製し、アレイ上で 1 時間インキュベートします。

対物レンズに油を一滴垂らします。ナノグリッドをステージに置いてイメージングします。透過した白色光を使用して、