タンパク質リン酸化分析のための単一分子プルダウンアッセイ:細胞溶解物中のタンパク質リン酸化を定量するハイスループット技術

0 views • 4:14 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

特定の細胞タンパク質のリン酸化は、その生物学的機能にとって重要です。

単一分子プルダウンアッセイを使用してインタクトタンパク質のリン酸化レベルを定量するには、まずグリッドアレイパターンのガラスカバーガラスを採取します。各コンパートメントは、タンパク質結合中の立体障害を防ぐために、通常のPEGと間隔をあけたビオチン化ポリエチレングリコールまたはPEGベースのリンカーでコーティングされています。

カバーガラスを還元試薬で処理して、分析における自家蛍光を最小限に抑えます。カバーガラスにニュートラビジン(ビオチン結合タンパク質)を重ねてインキュベートし、ビオチン化PEGリンカーに結合させます。

アレイに特異的な抗標的タンパク質抗体を補充します。各抗体には、そのFc領域に結合したビオチンが含まれており、抗体をニュートラビジンに固定し、固定化を引き起こします。

次に、標的タンパク質の緑色蛍光タグ付きリン酸化および非リン酸化バリアントを含む、さまざまなタンパク質を含む細胞培養ライセートを加え、インキュベートします。標的タンパク質の両方の変異体が抗体に捕捉され、複合体を形成します。結合していないタンパク質を洗浄して除去します。

次に、これらの複合体を、タンパク質のリン酸化残基に排他的に結合し、複合体に異なる蛍光シグナルを与える赤色蛍光タグ付き抗体の2番目のセットで処理します。

蛍光顕微鏡でアレイを画像化し、2つの異なる蛍光シグナルを観察します。両方の蛍光シグナルの共局在は、サンプル中にリン酸化タンパク質が存在することを示しています。

ビオチン-PEG官能化アレイを冷凍庫から取り出し、室温まで平衡化します。アレイを上に向けてカバーガラスを、シーリングフィルムで裏打ちされた100 mmの組織培養皿の上に置きます。アレイの各正方形を1ミリリットルあたり10ミリグラムの水素化ホウ素ナトリウムおよびPBSと室温で4分間インキュベートします。PBSで3回洗浄します。

次に、1ミリリットルあたり0.2ミリグラムのNeutrAvidinをT50中で5分間インキュベートし、続いてT50-BSAで3回洗浄します。T50-BSA中で1ミリリットルあたり2マイクログラムのビオチン化POI特異的抗体で10分間インキュベーションを繰り返し、続いて洗浄します。

まず、ピペッティングで溶解液を解凍し、混合します。1マイクロリットルのライセートを100マイクロリットルの氷冷T50-BSA / PPIに希釈します。ライセートをアレイ上で10分間インキュベートし、その後洗浄します。AF647 結合抗ホスホチロシン抗体を氷冷の T50-BSA/PPI 中で調製し、アレイ上で 1 時間インキュベートします。

対物レンズに油を一滴垂らします。ナノグリッドをステージに置いてイメージングします。透過した白色光を使用して、グリッドパターンに焦点を合わせます。グリッドの一連の 20 枚の画像を取得します。ピクセルが飽和していないことを確認し、画像シリーズを「基準」として保存します。

ナノグリッドの焦点をぼかしてエアリーパターンを作成します。ゲインキャリブレーションのために20枚の画像を連続して集録し、その画像を「ゲイン」として保存します。次に、カメラへの光をすべて遮断してカメラオフセット用の画像を20枚連続で取得し、その画像を「背景」として保存します。

SiMPull画像を取得するには、まずオイル対物レンズを洗浄し、対物レンズに追加のオイルを塗布します。カバーガラスアレイを顕微鏡ステージに固定します。各サンプルの画像を取得し、最初に遠赤色チャネルで取得し、次に低波長の蛍光色素で取得します。30〜45分ごとにバッファーレベルを確認し、必要に応じて補充してください。

12:47

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

Related Videos

0 Views

10:26

細胞内タンパク質間相互作用を研究するビオチン化セル透過ペプチド

Related Videos

0 Views

07:26

リンタンパク質分析のためのマウスフェイシャルプロセスおよび培養口蓋間葉系細胞からの全細胞タンパク質溶解物の単離

Related Videos

0 Views

15:41

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ

Related Videos

0 Views

11:13

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

Related Videos

0 Views

09:16

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

Related Videos

0 Views

07:42

抗体のアレイによるシグナル伝達経路の尋問でチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性の評価

Related Videos

0 Views

08:38

単一細胞解析、バイオ マーカー探索をシグナル蛍光セル バーコードとリン フローサイトメトリー

Related Videos

0 Views

11:23

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Related Videos

0 Views

06:49

小ヌクレオチド基質のポリヌクレオチドリン酸化を測定する非放射性アッセイ

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026