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代謝活性細胞では、炭素含有基質が一連の生化学反応によって酸化され、エネルギーを生成し、副産物として二酸化炭素を放出します。
基質の酸化速度を決定するには、目的の未分化細胞の接着培養から始めます。細胞を培地に、その骨格に放射性炭素14を含む適切な基質を補充し、インキュベートします。
細胞は基質を消費して酸化して放射性標識された二酸化炭素を放出し、細胞から周囲の媒体に拡散します。
この培地を過塩素酸を含むガストラップアセンブリに移して、反応を急冷します。このチューブには、チューブキャップの内側に水酸化ナトリウムを浸した濾紙が取り付けられています。キャップを閉じてインキュベートします。
インキュベーション中、二酸化炭素は気体の形でチューブ内で放出されます。水酸化ナトリウムは放射性標識された二酸化炭素を吸収し、ろ紙に閉じ込めます。このろ紙をシンチレーションカクテルの入ったバイアルに移し、液体シンチレーションカウンター内に置きます。
カウンター内では、放射性標識された炭素が放射性崩壊を起こし、高エネルギーのベータ粒子を放出します。これらの粒子はシンチレーションカクテルの成分に吸収され、シンチレーションカウンターによって計算される光パルスを放出します。
検出された放射能の量は、細胞内の基質の酸化速度と相関しています。
余分なウェルで細胞をDPBSで2回洗浄します。細胞を0.25%トリプシン-EDTAで解離します。20マイクロリットルの消化細胞を20マイクロリットルのアクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウム染料溶液でDPBSに再懸濁します。自動セルカウンターで生細胞の数を決定し、その数を記録します。
アッセイウェル内の細胞をDPBSで2回洗浄します。RAM指定の組織培養フード内の各アッセイウェルに500マイクロリットルのホット培地を加えます。プレートをパラフィルムで密封した後、細胞を摂氏37度のRAM指定インキュベーターで4時間インキュベートします。
インキュベーション中、ろ紙を1.5ミリリットルの微量遠心チューブのキャップの内側の領域よりわずかに大きい円形に切り、紙をキャップにぴったりと挿入します。各チューブに200マイクロリットルの1モル過塩素酸を加え、キャップ内に取り付けたろ紙に20マイクロリットルの水酸化ナトリウムを加えます。
細胞をインキュベートした後、各ウェルから400マイクロリットルの培地を準備したチューブに移し、すぐにキャップを閉じます。チューブを室温のチューブラックに1時間放置します。
並行して、インキュベーション中に、各チューブにシンチレーションバイアルをセットアップし、4ミリリットルのシンチレーション液で満たします。各濾紙をシンチレーションバイアルに移し、室温で30分間インキュベートします。
組織培養フード、ウォーターバス、冷蔵庫、インキュベーター、シンク、地面、その他の作業エリアで、RAM汚染の可能性がないか拭き取るテストを実施します。紙ワイプをシンチレーション液の入ったシンチレーションバイアルに入れます。
シンチレーションカウンターでシンチレーションバイアル内の炭素14放射能を測定し、読み取り結果を記録します。必要に応じて、放射線安全ガイドラインに従って作業環境を除染します。