0 閲覧数 • 4:08 分 • July 8th, 2025
血管新生は、発達中および病理学的状態中に既存の血管から新しい血管が形成されることです。血管の内面を覆う内皮細胞と周囲の周皮細胞(血管の外側の支持細胞)との間の広範なコミュニケーションは、血管新生にとって非常に重要です。
in vitro 血管新生を研究するには、フィブリノーゲン溶液 (フィブリン前駆体として作用する可溶性糖タンパク質) に懸濁された内皮細胞と周皮細胞でコーティングされたマイクロキャリアビーズから始めます。
次に、ビーズ懸濁液をトロンビン(タンパク質分解酵素)の溶液を含む培養プレートにピペットで入れ、インキュベートします。トロンビンはフィブリノーゲン分子に結合し、その切断によって不溶性フィブリンモノマーが形成され、高分子フィブリンゲルが形成されます。このステップにより、細胞でコーティングされたビーズがフィブリンゲルに確実に包埋されます。
次に、線維芽細胞(結合組織前駆細胞)の培養物をフィブリンゲルの上にプレートし、線維芽細胞の活性化を可能にするためにインキュベートします。
インキュベーション中、線維芽細胞は内皮細胞の活性化を引き起こす重要な血管新生成長因子を分泌します。接着した周皮細胞と内皮細胞は、フィブリンゲル内の内皮細胞の発芽を助けるシグナル伝達分子を分泌します。
内皮芽は、周皮細胞に包まれた細長い細胞突起として現れ、血管新生の初期段階
を表しています。マイクロキャリアでコーティングされたビーズの皿を20倍の倍率で顕微鏡で調べ、すべてのビーズが内皮細胞によって十分にコーティングされていることを確認します。
プレートを層流フードに移し、P1000ピペットを使用してコーティングされたビーズ溶液を激しく吸引して分注し、プレートの底から細胞を切り離し、上清を個々のチューブに移します。
ビーズをチューブの底に3分間沈殿させます。次に、P1000ピペットを使用して、ビーズクラスターを乱すことなく、できるだけ多くの上清を除去します。チューブあたり1ミリリットルの完全培地にビーズを再懸濁し、ビーズを30〜60秒間沈殿させます。P1000ピペットを使用して上清を再度吸引し、先ほど示したように、ビーズ懸濁液から自由浮遊する内皮細胞を新鮮な完全培地でさらに2回洗浄します。
3回目の洗浄後、ビーズを2.5ミリリットルのフィブリノーゲン溶液に再懸濁します。ウェルあたり13マイクロリットルのトロンビン溶液を、24ウェルのガラス底板に加えます。次に、0.5ミリリットルのビーズ/フィブリノーゲン溶液を各ウェルに加え、ビーズをトロンビンに直接慎重にピペットで入れ、ゆっくりと上下に2〜3回ピペットで溶液を完全に混合します。
すべてのウェルが播種されたら、トロンビン-フィブリノーゲン溶液を室温で30分間層流フード内で事前に凝固させます。インキュベーションの最後に、プレートを摂氏37度のインキュベーターにさらに1.5〜2時間慎重に移します。
ゲルが完全に固まったら、正常なヒト肺線維芽細胞を2 x 104細胞/ミリリットル濃度で完全培地に再懸濁し、各ウェルに1ミリリットルの線維芽細胞を加えます。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。