幼虫接触アッセイ:試験幼虫殺虫化合物との直接接触後の蚊の幼虫死亡率を評価する手順

試験幼虫殺虫化合物の可能性を評価するために、ドーパミン受容体拮抗薬は、幼虫接触アッセイを使用して、水性培地中の望ましい発育段階または齢期の生きた蚊の幼虫から開始します。同数の幼虫をマルチウェルプレートのウェルに移します。

幼虫に悪影響を与える可能性のある汚染物質による干渉を防ぐために、井戸内の培地を脱イオン水に交換してください。それぞれのウェルに濃度の高い試験化合物を追加します。

プレートをそっと回転させて、幼虫と試験化合物との接触を促進します。プレートを適切な条件下でインキュベートします。

幼虫と接触すると、試験化合物は体壁または最外層に入り、気門、気管系の開口部に到達し、気門は神経節(神経細胞のクラスター)に接続されています。

神経細胞では、試験化合物は、重要な細胞プロセスに関与するドーパミン受容体の二次結合部位に結合します。この結合は、神経伝達物質のドーパミンがドーパミン受容体に結合していても、受容体の活性化と下流のシグナル伝達を妨げ、幼虫の発育を妨害し、最終的には死に至ります。

さまざまな化合物濃度にわたる試験化合物曝露後の特定の時点で、各ウェルで動きのない無反応の幼虫の数を記録します。

濃度の増加に伴う幼虫死亡率の増加は、試験化合物の殺幼虫の可能性を示しています。

まず、透明な24ウェル組織培養プレートのウェルにラベルを付けます。分析天びんを使用して、試験化合物を計量します。次に、化合物を1.5ミリリットルチューブ内の滅菌二重蒸留水に溶解し、80ミリモルの原液を作ります。次に、二重蒸留水を使用して原液を連続希釈し、所望の濃度の作業原液を調製します。

幼虫を井戸に加えるとき、余分な水分を除去するとき、および試験化学物質を追加するときは、幼虫への物理的損傷を避けるために注意する必要があることに注意してください。損傷は死亡率を増加させ、偽陽性の結果を生じさせたり、アッセイを無効

にしたりする可能性があります。

ワイドボアプラスチックトランスファーピペットを使用して、5匹の3齢幼虫をプレートの各ウェルに移します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して水をそっと取り除き、必要な量の二重蒸留水と交換します。

水を取り除くときは、幼虫に触れないように注意してください。幼虫が乾燥しないように迅速に作業し、プラスチックウェルの反対側にピペッティングして試験化学物質をそっと追加します。

各ウェルに適切な量の試験溶液を追加し、プレートをゆっくりと回転させて均一に混合します。プレートを成長チャンバーに入れ、相対湿度75%から85%で摂氏25度で12時間の明暗サイクルを維持します。

幼虫の動きを確認するには、プレートを軽くたたきます。動きが観察されない場合は、滅菌つまようじで幼虫にそっと触れます。反応が見られない場合は幼虫を死んだものとしてスコアリングし、スコアシートを使用して、テキストプロトコルに記載されている時点で各ウェル内の死んだ幼虫の総数を記録します。