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外膜に存在するグラム陰性菌毒素であるエンドトキシンは、脂質A抗原やO抗原を含む脂質と多糖類を主成分とするリポ多糖類LPSです。感染中に放出されると、免疫系によって認識され、サイトカインベースの炎症反応が引き起
こされます。Limulus アメーバ細胞ライセート LAL アッセイを使用してリポソーム薬物ナノ製剤中のエンドトキシン汚染を推定するには、1 本は薬物を含み、もう 1 本は既知のエンドトキシン濃度でスパイクされた薬物を含む反応チューブを準備します。
カブトガニ、Limulus polyphemus、血球、またはアメーバ細胞から得られたタンパク質ライセートを含むLAL試薬を加えます。ライセートには、不活性なセリンプロテアーゼ(第B因子、第C因子、プロクロッティング酵素)とゲル凝固タンパク質であるコグローゲンが含まれています。
チューブをボルテックスし、濁度計にロードして溶液の濁度を測定します。
リポソーム薬に結合した汚染されたLPSの存在下では、LPS感受性第C因子Cが自己触媒的に活性化され、第B因子が切断されて活性化され、凝固促進酵素が凝固酵素に変換されます。この活性化酵素はコアグリゲンペプチド結合を切断し、コアグリンモノマーを形成します。
最終的に、モノマーは、一方の頭の露出した疎水性領域ともう一方の疎水性尾部の間の相互作用を介して重合し、不溶性の濁ったコアグリンゲルが凝集して形成されます。測定された濁度は、ナノ製剤中のエンドトキシン濃度を決定するのに役立ちます。
許容範囲内のスパイクサンプルおよび試験サンプルのエンドトキシン濃度からのスパイク回収率が計算されたところ、ナノ製剤による大きな干渉がないことが示され、ナノ製剤中のエンドトキシンの存在が検証されます。
キャリブレーション標準試料の調製には、900マイクロリットルのLimulusアメーボサイトライセートまたはLALグレードの水、および100マイクロリットルのコントロールスタンダードエンドトキシンを使用して、必要な数の中間希釈液を調製し、1ミリリットルあたり1エンドトキシン単位の濃度でキャリブレーション標準試料を調製できるようにします。
次に、900マイクロリットルのLALグレードの水と100マイクロリットルの1つのエンドトキシン単位/ミリリットル校正標準を使用して、0.1エンドトキシン単位/ミリリットルの濃度で2番目の校正標準を調製します。
次に、連続10倍希釈を繰り返して2つの下位校正標準物質を調製し、0.001〜1エンドトキシン単位/ミリリットルの範囲の合計4つの校正標準物質を取得します。
0.05 エンドトキシン単位/ミリリットルの品質管理を調製するには、50 マイクロリットルの 1 エンドトキシン単位/ミリリットルのコントロール標準エンドトキシン溶液と 950 マイクロリットルの LAL グレードの水を混ぜます。
次に、ソフトウェアで「機器設定」を選択し、テンプレートを作成します。 「データの収集」を選択し、「一般」タブにテストIDとデータグループを入力します。[ハードウェア]タブで、機器の種類とLALメソッドを選択し、シリアル番号、システムID、およびシリアルポート情報が画面に表示されることを確認します。
「OK」を2回クリックして、装置の選択と装置との通信を確認し、サンプルをテストするのと同じ順序でサンプルIDを入力します。次に、デフォルトのボタンを使用して、ネガティブコントロール、標準曲線、およびテストサンプルを入力します。
適切な量のネガティブコントロールキャリブレーション標準物質と品質管理を、標識済みのガラス管を複製し、適切な量のLALを最初のテストバイアルに加えます。バイアルを短時間渦巻き、バイアルを機器カルーセルの適切なテストスロットに入れます。
サンプルをロードする前に、示されている最大有効希釈内で試験ナノ材料を数回希釈します。