JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 2:57 分 • July 8th, 2025
グラム陰性菌の外膜には、リポ多糖類(LPS)と呼ばれるエンドトキシンが含まれています。LPSは、親水性オリゴ糖部分と疎水性脂質A領域を持っています。
宿主の内部に入ると、LPS結合タンパク質はエンドトキシンを認識します。次に、これらのタンパク質は循環免疫細胞の受容体に結合します。この結合により免疫細胞が活性化され、炎症因子が放出されます。これらの因子の過剰産生は免疫応答を誇張し、細胞死を引き起こします。
Limulus Amoebocyte Lysate(LALアッセイ)を使用してエンドトキシンを検出するには、疎水性脂質A部分を介してナノ粒子の親油性表面に結合したエンドトキシンを含む製剤を使用します。
LAL試薬をチューブに加えます。この試薬は、アメーボサイト(カブトガニの血球)に由来する不活性酵素とタンパク質を含む水性溶解物です。
チューブをインキュベートして、エンドトキシンとライセート由来の不活性凝固因子Cプロエンザイムへの結合を促進し、自己触媒的に活性化します。
活性化された第C因子は、別のプロ酵素である第B因子を切断し、凝固促進酵素を切断して活性型であるリムルス凝固酵素に変換するプロテアーゼを形成します。この酵素は、不活性な凝固タンパク質である凝固球菌をコアグリンに切断します。
コアグリンモノマーは、疎水性の尾部を介して他のコアグリンモノマーの疎水性ヘッドに結合します。この自己重合により、チューブの基部にゼラチン状の凝固として現れるホモポリマーが形成されます。チューブをそっと反転させます。
チューブの底に残っている固い血栓は、エンドトキシンの存在を確認します。
ゲル凝固LALを実行するには、コントロール標準エンドトキシンを4ラムダの最終濃度に調製し、100マイクロリットルの標準と100マイクロリットルの水または試験サンプルを組み合わせて、コントロール標準エンドトキシン2ラムダの最終濃度を達成します。
各ラムダ希釈液に100マイクロリットルのライセートを加えます。チューブを短時間渦に巻き込み、チューブのラックを摂氏37度のウォーターバスに1時間入れます。
インキュベーションの最後に、チューブを滑らかな動きで反転させ、硬い血栓の場合はプラス、血栓がない、または緩い血栓の場合はマイナスを使用して結果を手動で記録します。