$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
炭水化物分解酵素は、複雑な多糖類をより小さなオリゴ糖に分解します。
酵素分解活性をスクリーニングするには、まず、多糖類を異なる色のクロロトリアジン染料で染色することによって調製された複数の発色ポリマーヒドロゲル CPH を採取します。次に、各多糖類を化学的に架橋して、酵素分解のための合成基質であるヒドロゲルを形成します。
次に、異なるCPH基質を多孔質反応プレートの別々のウェルに分注します。活性化溶液を加えてインキュベートし、基質の最適な活性化を確保します。
アッセイプレートを空の製品プレートの上に置きます。プレートを低速で遠心分離して、反応プレートの細孔から活性化溶液を効率的に除去します。
次に、酵素活性に最適なpHを維持する適切なバッファーで、反応プレートのすべてのウェルに同じタイプの炭水化物分解酵素を補充します。プレートを密封し、穏やかな攪拌でインキュベートして、酵素がポリマーネットワークに均一に分布し、基質にアクセスできるようにします。
インキュベーション中、酵素は基質に対して適切な活性を持ち、CPH中の多糖類を分解して、より小さな色素結合オリゴ糖を生成します。これらの生成物は可溶性であり、溶液を着色します。プレートを回転させて、着色された溶液を製品プレートに集めます。
分光光度法で、酵素活性を測定するための生成物吸光度を決定します。
まず、各ウェルに200マイクロリットルの活性化溶液を加えて、96ウェルフィルターアッセイキットプレートを活性化します。撹拌せずに室温で10分間インキュベートします。
遠心分離機と標準的な96ウェルプレートを使用して収集し、現存する活性化溶液をスピンダウンします。発色ポリマーヒドロゲル(CPH)基質に100マイクロリットルの滅菌水を加え、真空またはスピンを加えて安定剤を除去します。さらに2回洗濯を繰り返します。
酵素反応を調製するには、150マイクロリットルの100ミリモル酢酸ナトリウムバッファーpH 4.5と、5マイクロリットルの3つの異なる濃度のエンドセルラーゼ溶液をアッセイキットプレートの各ウェルに加えます。
プロダクトプレートをアッセイキットプレートの下に置き、振とう中に反応プレートから漏れる可能性のあるものを収集します。次に、アッセイキットプレートを室温で水平シェーカーで100 RPMで30分間インキュベートします。
信頼できるデータを受け取るには、インキュベーション中に反応混合物を撹拌する必要があります。
アッセイキットプレートとその下にプロダクトプレートを置いたアッセイキットプレートを遠心分離機に置き、2,700 x g で10分間スピンダウンして、反応生成物をプロダクトプレートのウェルに移します。
スピン後、製品プレートを目視検査して、各ウェル内の液体の量がほぼ同じであることを確認します。プレートリーダーを使用して、さまざまな緑色のCPH基板について、630ナノメートルでの収集プレートの吸光度を読み取ります。