不溶性発色バイオマス基底酵素スクリーニング:植物バイオマス分解酵素の分解活性を評価するためのアッセイ

バイオマスは、主に複雑な多糖類で構成される植物由来の有機物です。炭水化物分解酵素がこれらの多糖類に作用して、より小さなオリゴ糖を生成します。

酵素の分解活性を評価するには、まず、多孔質反応プレートのウェルに存在するさまざまな不溶性発色バイオマス - ICB基質を採取します。これらの基質は、植物由来の材料を特定の色のクロロトリアジン染料で染色することから得られます。得られたバイオマスには、酵素活性の基質として機能する色素タグ付き複合多糖類が含まれています。

次に、炭水化物加水分解酵素を含む緩衝液を追加します。バッファーは、最適な酵素活性のためにpHを維持します。反応プレートをシェーカーに置き、インキュベートします。絶え間ない撹拌により、酵素分子はICB基質中の標的多糖類に到達できます。

インキュベーション中、加水分解酵素は長鎖多糖類内の共有結合グリコシド結合を切断します。この反応により、染料分子に結合した可溶性オリゴ糖が生成され、溶液中に残ります。

分解が完了したら、反応プレートを生成プレートの上に置き、アセンブリを遠心分離します。遠心分離中、反応生成物を含む着色溶液はプレートの底部にあるフィルターを通過し、生成物プレートに収集されます。プレートリーダーを使用して、上清の吸光度を記録します。

吸光度値が高いほど、色素結合オリゴ糖が大量に生成されることを示し、ICB基質を分解する酵素の効率を示します。

赤色の不溶性発色バイオマス(ICB-小麦わら)で発色アッセイを実行するには、まずアッセイプレートの各ウェルに200マイクロリットルの活性化溶液を加えます。次に、プレートを室温で10分間攪拌せずにインキュベートします。

100マイクロリットルの滅菌水を使用して、井戸を3回洗浄して安定剤を取り除きます。次に、150マイクロリットルの100ミリモル酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4.5、および5マイクロリットルの10単位の異なるエンドキシラナーゼ溶液を加えます。

製品プレートを基質プレートの下に配置して、振とう中に基質プレートからの潜在的な漏れを収集し、反応を室温および100 RPMで2時間インキュベートします。

インキュベーション後、アッセイキットプレートをその下に製品プレートを置いて遠心分離機に入れ、2,700 x g で10分間スピンダウンして、反応生成物を製品プレートのウェルに移します。

各ウェル内の液体の量がほぼ同じであることを確認してください。次に、プレートリーダーを使用して、赤いICB小麦わらの517ナノメートルでの収集プレートの吸光度を読み取ります。