0 閲覧数 • 4:31 分 • July 8th, 2025
マイトカンは、がん細胞のミトコンドリアの機能に選択的に影響を与え、アポトーシスを誘導する薬物の一種です。
マイトカン細胞毒性を決定するには、半接着性がん細胞を含む細胞懸濁液をマルチウェルプレートに播種します。プレートを目的のマイトカン溶液で処理し、インキュベートします。
ミトカンはがん細胞に侵入してミトコンドリアの活性を破壊し、最終的にはマイトカン感受性がん細胞の細胞死を引き起こします。ヘヒスト色素とヨウ化プロピジウムの混合物を含む染色液で細胞を処理します。
膜透過性蛍光色素であるヘヒストは、すべての細胞に浸透し、そのDNAのATに富む領域に結合し、生細胞と死細胞の両方の核に青色の蛍光を与えます。
対照的に、膜不透過性蛍光色素であるヨウ化プロピジウムは、膜の損傷した部分からのみ死細胞に侵入します。色素はDNA塩基の間に挿入され、死んだ細胞に追加の赤色蛍光を与えます。これらの細胞の核に両方の色素が存在すると、死んだ細胞が紫色に見えます。
プレートを低速で遠心分離して細胞を沈降させ、イメージング中の精度を高めます。蛍光顕微鏡で画像化し、2つの異なる細胞集団を観察します。両方のセルタイプの数を数えます。
総集団と比較した死んだ集団を表す紫色の細胞の割合は、試験マイトカンの細胞毒性の可能性を示しています。
目的の化合物の溶液を所望の濃度で調製することから始めます。常に完全にボルテックスして化合物を混合するようにしてください。
単一化合物の細胞毒性を測定するには、最終濃度の2倍で化合物を調製します。化合物の組み合わせの細胞毒性を測定する場合は、最終濃度の4倍で調製してください。
同量の溶媒を適切な培地と混合して、溶媒のみのコントロールを調製します。細胞を15ミリリットルの円錐形チューブに集め、10マイクロリットルの細胞懸濁液を分注してトリパンブルー染色を行います。10マイクロリットルの0.4%トリパンブルーをアリコートに加え、血球計算盤または細胞カウンターを使用して、生存細胞と非生存細胞をカウントします。
15ミリリットルチューブに200 x g で5分間ペレット細胞を置き、上清を吸引またはデカントします。細胞ペレットをアッセイに適した培地に、1ミリリットルあたり3x10 5細胞の細胞密度で再懸濁します。マルチチャンネルピペットを使用して、50マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに播種します。
単一化合物アッセイの場合は、50マイクロリットルの2X化合物溶液を各ウェルに加えます。溶媒制御ウェルの場合は、2倍濃度の溶媒を含む50マイクロリットルの試験培地を追加します。組み合わせアッセイの場合は、4X化合物のそれぞれを各ウェルに25マイクロリットル加えます。単一の化合物対照ウェルの場合、4X化合物溶液と試験培地をそれぞれ25マイクロリットル添加します。DMSOの最終濃度が0.5%を超えないようにしてください。
再現性を確保するために、ピペットの先端がウェルの側面に接触して薬剤を追加し、薬剤を別の場所に追加するように注意してください。このステップは非常に迅速に実行する必要があり、できればプレートあたり 30 分以内に完了する必要があります。
プレートを軽くたたいてウェルの内容物を混合し、摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。
Hoechst 33342とヨウ化プロピジウムで細胞を染色する準備ができたら、新鮮な10X染色液を調製し、各ウェルに10マイクロリットルを加えます。プレートを軽くたたき、摂氏37度で15分間インキュベートします。
プレートを200 x g で4分間遠心分離し、すべての細胞をプレートの底に持っていきます。次に、湿らせた実験用ワイプでプレートの底を注意深く拭き、画像処理を妨げる可能性のある破片を取り除きます。遠心分離後15分以内にプレートを画像化します。