溶血アッセイ:ヒト赤血球中のカルシウムイオノフォア誘発溶解を測定するためのIn vitro法

溶血は、赤血球が破裂して細胞内容物を周囲の空間に放出することです。

溶血をアッセイするには、体液に対してグルコースを含まない電解質を含む等張溶液中の赤血球を含むチューブから始めます。この溶液は赤血球を無傷に保ち、グルコースがないため細胞ストレスが誘発されます。これによりカチオンチャネルが活性化され、カルシウムイオンが細胞の細胞質ゾル空間に入ることができます。

カルシウムイオンに結合して細胞質ゾルへの輸送を促進し、赤血球内にカルシウムイオンの過負荷を引き起こす最適なカルシウムイオノフォア濃度を含む溶液を追加します。

この流入により、原形質膜の脂質単層間でリン脂質を転座させるタンパク質であるスクランブラーゼが活性化され、その非対称性が破壊されます。この現象はまた、内側の単層リン脂質であるホスファチジルセリンを、赤血球のプログラム死であるエブリプトーシスの指標である外側の単層に移動させます。

細胞質ゾルカルシウムイオンの増加は、カリウムチャネルを活性化し、カリウムイオンを細胞から追い出します。浸透圧の不均衡は、水分の損失と赤血球の収縮につながります。カルシウムイオノフォアに長時間さらされると溶血が誘発され、溶液へのヘモグロビンの漏出が引き起こされます。

赤血球懸濁液を遠心分離し、上清の吸光度を測定して、溶血した赤血球から放出されるヘモグロビンの量を定量します。

1ミリグラムのイオノマイシンカルシウム塩を630マイクロリットルのDMSOに溶解し、最終濃度2ミリモルに達します。20マイクロリットルにアリコートし、摂氏マイナス20度で保管します。

調製した0.4%ヘマトクリットを1ミリリットル取り、0.5マイクロリットルの2ミリモルアイオノマイシンを加えて、最終濃度1マイクロモルに達します。摂氏37度で2時間インキュベートします。ネガティブコントロールとして、イオノマイシン処理を行わずにヘマトクリット1ミリリットを使用します。イオノマイシン処理および未処理のヘマトクリットを室温で700倍gで室温で5分間遠心分離し、それらの上清を除去して、チューブの底に細胞ペレットを残します。

細胞ペレットを1.5ミリリットルのリンゲル液に懸濁し、室温で700回gで5分間遠心分離し、上清を廃棄することにより、リンゲル液で細胞を3回洗浄します。

溶血を測定するには、未処理の0.4%ヘマトクリット1ミリリットルを微量遠心チューブに加え、溶血率0%で陰性対照として摂氏37度で2時間インキュベートします。

100%溶血のポジティブコントロールを調製するには、未処理の0.4%ヘマトクリット1ミリリットルを微量遠心チューブに加え、室温で700回gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、細胞ペレットに蒸留水1ミリリットルを加えて再懸濁させ、摂氏37度で2時間インキュベートします。

次に、1ミリリットル