In vitro Glucose Depletion Assay:細胞外グルコース枯渇測定による細胞グルコース取り込みを定量化する蛍光ベースの方法

主要な細胞エネルギー源であるグルコースは、細胞膜グルコーストランスポータータンパク質を介して細胞に侵入します。グルコースは、解糖経路を介して細胞細胞質でピルビン酸に分解され、細胞代謝のためにアデノシン三リン酸(ATP)を介してエネルギーを生成します。

細胞内グルコース取り込みを測定するには、マルチウェルプレートでの線維芽細胞の接着培養から始めます。培地をグルコースフリー培地と交換し、インキュベートします。細胞は利用可能なブドウ糖を代謝してエネルギーを生成し、ブドウ糖欠乏状態に達します。

1セットのウェル内の培地を、グルコース取り込み刺激剤であるインスリンとグルコース類似体である蛍光デオキシグルコースを含むグルコースフリー培地に交換します。蛍光デオキシグルコースを含むグルコースフリー培地で別のウェルセットを処理します。

インキュベーション中、インスリンは追加のグルコーストランスポーターの原形質膜への転座を刺激し、グルコースがない場合に蛍光デオキシグルコース取り込みの増加を促進します。

デオキシグルコースはリン酸化され、細胞によってそれ以上代謝されません。同時に、蛍光デオキシグルコースの細胞外濃度が低下します。

インキュベーション後、未利用の蛍光デオキシグルコースを含む培地を収集します。細胞を溶解バッファーで処理します。緩衝液中の界面活性剤はミセルを形成し、細胞膜を可溶化し、細胞内内容物の放出を引き起こします。

マイクロプレートリーダーを使用して、細胞内蛍光デオキシグルコースを含む細胞ホモジネートと未利用の細胞外蛍光デオキシグルコースを含む培地の蛍光を測定します。

インスリン刺激線維芽細胞は、非刺激細胞と比較して、細胞内蛍光デオキシグルコース取り込みの増加とそれに対応する細胞外蛍光デオキシグルコースの減少を示します。

シミュレーション条件ごとに 8 つのレプリケートを使用します。したがって、シミュレーション条件ごとに1ミリリットルを用意します。

インスリンなしで7つのシミュレーション条件を使用します:1つの96ウェルプレートで、2.5マイクログラム/ミリリットル、1マイクログラム/ミリリットル、0.5マイクログラム/ミリリットル、0.2マイクログラム/ミリリットル、0.1マイクログラム/ミリリットル、0.05マイクログラム

インスリンで7つの刺激条件を使用します:2.5マイクログラム/ミリリットル、1マイクログラム/ミリリットル、0.5マイクログラム/ミリリットル、0.2マイクログラム/ミリリットル、0.1マイクログラム/ミリリットル、0.05マイクログラム/ミリリットル、および0マイクログラム/ミリリットル別の96ウェルプレート。

刺激条件を準備するには、1ミリリットルあたり5ミリグラムのFD-グルコース作業溶液と999マイクロリットルの無グルコースDMEMを希釈して、1ミリリットルの作業原液を取得します。

この作業原液を使用して、1:2000、1:5000、1:10000、1:25000、1:50000、および1:100,000のFD-グルコース希釈液を調製して、2.5マイクログラム/ミリリットル、1マイクログラム/ミリリットル、0.5マイクログラム/ミリリットル、0.2マイクログラム/ミリリットル、0.1マイクログラム/ミリリットル、0.05マイクログラム/ミリリットルを、ライトのないバイオセーフティキャビネットで実験の直前に2ミリリットルチューブに入れます。これらの条件のそれぞれに1マイクロリットルのインスリンを追加します。

40分間のインキュベーション後、96ウェルプレートの各ウェルからグルコースフリーDMEMをデカントし、滅菌ペーパータオルで残りの液体を吸収します。前述の様々な処理条件からそれぞれ100マイクロリットルを1つのカラムに沿ったウェルに加え、同じ処理条件から100マイクロリットルを両方の96ウェルプレートの列に沿ったウェルに加えます。インスリンの有無にかかわらず、条件を利用したプレートにラベルを付けます。

コースフリーDMEMをコントロールウェルに単独で追加します。暗所の細胞培養インキュベーターでプレートを40分間インキュベートします。

細胞を40分間刺激した後、同じ実験レイアウトを維持しながら、両方のプレートから新しい96ウェルプレートに刺激培地を移します。細胞をPBSで洗浄します。PBSを取り除き、滅菌ペーパータオルに残っている溶液をデカントします。

タンパク質を保護するために、放射免疫沈降アッセイバッファーにプロテアーゼ阻害剤を追加します。放射免疫沈降アッセイを含むプレートをシェーカーに30分間置きます。

マイクロプレートリーダーを使用して、最初に細胞外FD-グルコースを含む培地で、それぞれ485ナノメートルと535ナノメートルの励起波長と発光波長で蛍光を測定し、次に30分間のインキュベーションの終わりに放射免疫沈降アッセイで溶解した細胞を含むプレートを測定します。