In vitro Glucose Depletion Assay:細胞外グルコース枯渇測定による細胞グルコース取り込みを定量化する蛍光ベースの方法

主要な細胞エネルギー源であるグルコースは、細胞膜グルコーストランスポータータンパク質を介して細胞に侵入します。グルコースは、解糖経路を介して細胞細胞質でピルビン酸に分解され、細胞代謝のためにアデノシン三リン酸(ATP)を介してエネルギーを生成します。

細胞内グルコース取り込みを測定するには、マルチウェルプレートでの線維芽細胞の接着培養から始めます。培地をグルコースフリー培地と交換し、インキュベートします。細胞は利用可能なブドウ糖を代謝してエネルギーを生成し、ブドウ糖欠乏状態に達します。

1セットのウェル内の培地を、グルコース取り込み刺激剤であるインスリンとグルコース類似体である蛍光デオキシグルコースを含むグルコースフリー培地に交換します。蛍光デオキシグルコースを含むグルコースフリー培地で別のウェルセットを処理します。

インキュベーション中、インスリンは追加のグルコーストランスポーターの原形質膜への転座を刺激し、グルコースがない場合に蛍光デオキシグルコース取り込みの増加を促進します。

デオキシグルコースはリン酸化され、細胞によってそれ以上代謝されません。同時に、蛍光デオキシグルコースの細胞外濃度が低下します。

インキュベーション後、未利用の蛍光デオキシグルコースを含む培地を収集します。細胞を溶解バッファーで処理します。緩衝液中の界面活性剤はミセルを形成し、細胞膜を可溶化し、細胞内内容物の放出を引き起こします。

マイクロプレートリーダーを使用して、細胞内蛍光デオキシグルコースを含む細胞ホモジネートと未利用の細胞外蛍光デオキシグルコースを含む培地の蛍光を測定します。

インスリン刺激線維芽細胞は、非刺激細胞と比較して、細胞内蛍光デオキシグルコース取り込みの増加とそれに対応する細胞外蛍光デオキシグルコースの減少を示します。

シミュレーション条件ごとに 8 つのレプリケートを使用します。したがって、シミュレーション条件ごとに1ミリリットルを用意します。

インスリンなしで7つのシミュレーション条件を使用します:1つの96ウェルプレートで、2.5マイクログラム/ミリリットル、1マイクログラム/ミリリットル、0.5マイクログラム/ミリリットル、0.2マイクログラム/ミリリットル、0.1マイクログラム/ミリリットル、0.05マイクログラム

/ミリリットル。

インスリンで7つの刺激条件を使用します:2.5マイクログラム/ミリリットル、1マイクログラム/ミリリットル、0.5マイクログラム/ミリリットル、0.2マイクログラム/ミリリットル、0.1マイクログラム/ミリリットル、0.05マイクログラム/ミリリットル、および0マイクログラム/ミリリットル別の96ウェルプレート。

刺激条件を準備するには、1ミリリットルあたり5ミリグラムのFD-グルコース作業溶液と999マイクロリットルの無グル