Gliding Actin Filament Assay:固定化ミオシン上のアクチンフィラメントの転座を研究するためのIn Vitro運動性アッセイ

運動タンパク質であるミオシンは、別の糸状タンパク質であるアクチンと相互作用し、その転座を引き起こします。

アクチンの滑走運動を分析するには、チャンバー上部の内側がニトロセルロースでコーティングされるように、スライドベースのフローチャンバーを組み立てます。ミオシンタンパク質がチャンバー内を流れ、ニトロセルロースコーティングの上に固定化されます。

チャンバーに標識されていないアクチンフィラメント(黒色アクチン)を補充し、アデノシン三リン酸またはATP分子を含む運動性バッファーを追加します。

アクチンフィラメントは、不活性または死んだミオシンとともに固定化された活性ミオシンに結合します。ATP 分子は活性ミオシンと相互作用し、黒色アクチンからの解離につながりますが、不活性ミオシンはアクチン結合したままになります。

黒色アクチンに結合した不活性ミオシンをペレット化するための遠心分離機。緩衝液で完全にすすぎ、不活性なミオシンペレット、遊離アクチンフィラメント、および未使用のATPを除去します。固定化された活性ミオシンに結合する蛍光標識アクチンの流れ

チャンバーに、混雑剤(メチルセルロース、およびATP)を含む最終緩衝液を補充します。混雑剤は、アクチンフィラメントをチャンバー表面に近づけるように強制します。

各活性ミオシンはATPを加水分解し、コンフォメーションの変化を引き起こし、フィラメントに沿った新しい位置に結合し、ミオシン上でアクチンを滑らせるパワーストロークを生成します。

蛍光顕微鏡でチャンバーを観察し、固定化されたミオシンヘッドの上をスムーズに滑る標識アクチンフィラメントの動きを記録し、転座が成功したことを確認します。

まず、酢酸アミルに1%ニトロセルロース溶液を調製し、直径125ミリメートルの円形濾紙を組織培養プレートの底に置きます。

正方形のカバーガラスを8枚ラックにセットし、約2〜5ミリリットルの200プルーフエタノールでよく洗い、続いて2〜5ミリリットルの蒸留水でよく洗います。次に、ろ過されたエアラインまたは窒素ラインを使用してカバーガラスを完全に乾燥させます。

10マイクロリットルの1%ニトロセルロース溶液を1つのカバーガラスの片方の端に沿ってゆっくりとピペットで入れます。200マイクロリットルのピペットチップの側面を使用して、カバーガラスの残りの部分に1回のスムーズな動きで塗りつけます。次に、このカバーガラスをニトロセルロース側を上にして組織培養皿の上に置きます。残りのカバーガラスについてこれを繰り返し、乾燥させます。

顕微鏡スライドを光学レンズペーパーで拭き取り、大きな破片を取り除きます。両面テープを2枚程度の長さでカットし、顕微鏡スライドの長辺の真ん中に1枚を置きます。2 枚目のテープを最初のテープの約 2 mm 下に置き、2 つが平行になるよ